[发明专利]一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒。

背景技术

地中海贫血又称海洋性贫血，由于最初发现于地中海沿岸的国家，如意大利、希腊、马尔他等国而得名。它是一组遗传性溶血性贫血病，由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致。组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链，分别由其相应的基因编码，这些基因的缺失或点突变可造成各种肽链的合成障碍，致使血红蛋白的组分改变。通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中α地中海贫血是最主要的地中海贫血类型之一，也是全世界最常见的遗传病之一。我国南方为α地中海贫血病的高发区，全国90万人的流行病学调查得出的总发病率为2.46％。

α地中海贫血是由位于人类16号染色体末端的α-珠蛋白基因缺陷所致，可划分为缺失型和非缺失型两大类，其中，缺失型发病率远高于非缺失型。α-珠蛋白基因的结构见图1，图中显示，编码α类珠蛋白基因串联在一起组成α-珠蛋白基因簇，从5′至3′依次为ξ2-ψξ1(假ξ)-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1。其中，ξ产生胎儿血红蛋白的组成成分ξ珠蛋白链，在胎儿早期表达，后期至出生后，逐渐被α2，α1所代替。α2，α1是两个重要的功能基因，虽然二者的序列99.99％都完全相同，但研究表明，α2基因的表达要比α1强。其余四个基因即ψξ，ψα2，ψα1，θ1都是假基因，不表达蛋白，但其序列与α基因也高度同源。

迄今在亚洲地区和国家α地中海贫血患者中已发现多种大片段α基因的缺失，如，发现于菲律宾人群中的菲律宾型缺失(--Fil)和发生于泰国人群中的泰国型缺失(--Thai)。而在我国迄今发现三种缺失型：右侧缺失型(-α3.7)、左侧缺失型(-α4.2)和东南亚型(--SEA)。-α3.7型主要缺失的是α1基因，缺失片段长3.7Kb；-α4.2型缺失的是α2基因，缺失片段长4.2Kb；而东南亚型 (--SEA)2个功能基因即α2，α1全部缺失，缺失片段长达20Kb。--SEA型的携带者(--SEA/αα)的染色体中一条16号染色体上缺失20Kbα基因簇片段，而另一条正常，会显示一定的贫血症状，病理生理改变轻微，即轻型α地贫(α0-地贫)。而东南亚型(--SEA)的纯合子(--SEA/--SEA)，其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HhA、HbA2和HbF的合成均减少，是α-地贫中最为严重的一种，即重型α地贫。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ4(Hb Bart′s)，Hb Bart′s对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征，胎儿常于30～40周时流产、死胎或娩出后半小时内死亡。

目前对α地中海贫血尚无有效的治疗方法，因此开展遗传筛查和产前诊断选择性淘汰重症α地贫胎儿是控制该病发生最有效的预防措施。由于基因诊断取材不受组织器官特异性限制，怀孕早期的绒毛或中期的羊水均可用于检测，因此目前大都利用基因诊断技术进行遗传筛查和产前诊断。经典的Southern杂交技术能诊断Hb Bart′s水肿胎，但因该法操作繁琐、实验周期长、使用放射性核素标记等诸多限制，而不利于临床推广应用。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是针对现有的检测方法的缺陷，提供一种简便、快捷，灵敏度高的检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法，为针对Genebank登录号为AE006462的α类珠蛋白基因，在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段断端的两侧设计一对引物Fd5和Rd3及探针Prob-D，在缺失片段5′端设计一条反向引物Rq5及探针Prob-Q，其中，所述引物Fd5为第155115至第155755位之间长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rd3为与第174721至第175321位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rq5为与第155395至第155895位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，所述Prob-D为与第174780至第174900核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Prob-Q为与第155533至第155653位核苷酸序列区域互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序 列，Prob-D和Prob-Q标记不同波长的报告荧光基团；

提取待测样品DNA，以待测样品DNA为模板进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。