[发明专利]一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种完全培养基，其特征在于：它是按体积比向低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液中加入3％-10％的人自体脐带血血清配制而成。

2.根据权利要求1所述的完全培养基，其特征在于：所述低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液这样制备：取低糖-Dulbecco极限必须培养基10g溶于1000ml超纯水中，调pH值至7.2-7.4，过滤除菌，分装，4℃保存，即可。

3.根据权利要求1所述的完全培养基，其特征在于：所述人自体脐带血血清这样制备：无菌条件下抽取脐带血50-70ml，注入无菌玻璃瓶中，静置于37℃培养箱2h，待血凝块完全析出后，无菌条件下，超净台中吸取析出的血清，移入新的无菌离心管内，4℃、1000g离心20min，收集上清15-20ml，56℃水浴灭活30min，0.2μm滤器除菌后，血清分装于5ml小瓶，-20℃保存、备用；同时进行培养，检菌，无细菌生长即可。

4.一种人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：(1)分离：将羊膜组织用D-Hank’s液冲洗干净，剪碎，分装于离心管内，用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液重复消化、过滤3次，剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液旋转消化，至组织完全消化，过滤，收集细胞滤液，离心，弃上清；(2)原代培养：离心后的沉淀用完全培养基进行原代培养；(3)传代培养：待人羊膜间充质干细胞生长到80％-90％融合后，再进行传代培养。

5.按照权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：步骤(1)中用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液消化的过程为：先于37℃消化10min，弃去消化液；再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；同样方法重复消化、过滤2次。

6.按照权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：步骤(1)中的旋转消化条件为37℃、200rpm，消化时间为2h，经300目不锈钢网滤过，收集细胞滤液于离心管。

7.按照权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：步骤(2)所述原代培养过程为：用含3％-10％人自体脐带血血清的完全培养基悬浮细胞后计数，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，观察细胞生长情况。

8.按照权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：步骤(3)所述传代培养过程为：取对数生长期内，融合率80％-90％的人羊膜间充质干细胞，弃去原有培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125％胰蛋白酶消化液30s-1min，观察消化程度，及时用完全培养基终止消化，收集细胞，离心，弃上清，沉淀用完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。

9.按照权利要求4-8中任一项所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于：(1)分离：将羊膜组织用D-Hank’s液反复冲洗，除尽残留的血迹，刮出羊膜表面的血管、粘液，剪碎羊膜分装于离心管内，加2.5-3倍体积的0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA-2Na消化液，37℃消化10min，弃去消化液，再于37℃、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；继续用同样方法重复消化、过滤2次；消化后剩余的羊膜组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液，37℃、200rpm旋转消化2h，至组织完全消化，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液于离心管，1500r/min离心10min，弃上清；(2)原代培养：离心后的沉淀用完全培养基悬浮后，台盼蓝染色、计数，当细胞活力＞90％后，按1×10⁷cells/ml的细胞密度接种于培养瓶，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，观察细胞生长情况；(3)传代培养：待人羊膜间充质干细胞生长到80％-90％融合后，弃去原有的培养液，用D-Hank’s洗涤，加入适量0.125％胰蛋白酶消化液30s-1min，观察消化程度，及时用完全培养基终止消化，收集细胞，1500r/min离心5min，弃上清，沉淀用完全培养基重新悬浮，按1×10⁵/ml的细胞密度传代接种，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3-5d换液、传代一次，每日观察细胞生长情况。