[发明专利]一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymalstem cells，hAMSCs)的培养方法，属于细胞工程及生物医药技术领域。

背景技术

人羊膜为附着在胎盘绒毛膜表面的一层半透明薄膜，属于胎膜组织的一部分，由胚胎发育期的细胞滋养层演化而来。除人羊膜上皮细胞以外，hAMSCs是构成人羊膜组织的主要细胞类型之一，表达胚胎干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的标志，具有多谱系分化潜能，是一种具有代表性的MSCs。在体外特定诱导条件下，hAMSCs可分化成来自三个胚层的所有细胞，包括神经细胞、心肌样细胞、胰腺细胞和肝细胞等。hAMSCs因其多向分化潜能和低免疫原性，体外扩增能力明显强于骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，加之其来源丰富，易于富集，不牵涉医学伦理问题等优势，且目前临床已用于角膜损伤、眼皮肤损伤和肌腱损伤等治疗，并取得较好的治疗效果。因而，hAMSCs在体细胞治疗和组织工程研究中显示出良好的应用前景。

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)含有丰富的生长因子、营养成分及维持细胞生长的激素，还可为细胞贴壁、铺展提供所需的因子。因此，干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如FBS)的培养基，BMSCs和脐带血间充质干细胞的培养也多采用FBS。目前，hAMSCs的培养体系通常为LG-DMEM培养基中加入10％的FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、55μmol/L 2-巯基乙醇和1mmol/L丙酮酸钠，传代培养2-4代，hAMSCs的表面标志与BMSCs相似，除表达典型的间充质细胞标志，如：波形蛋白(vimentin，VIM)、CD105⁺、CD90⁺、CD73⁺、CD44⁺、CD29⁺、HLA-A，B，C⁺、CD13⁺、CD10⁺、CD49c⁺、CD49d、CD49e⁺、CD54⁺和CD166⁺、CD271低表达，CD14^-、CD34^-、CD45^-、CD31^-、CD133^-和CD3^-，不表达HLA-DR，还表达干细胞标志Oct-4、TRA-1-60、SSEA-3、SSEA-4和其他CD分子CD349、CD140b和CD324(E-cadherin)等。但FBS等动物血清的应用，在干细胞移植后，输入异种蛋白对患者存在潜在的威胁，可产生抗FBS抗体及其他尚未知晓的不良反应，而且可能造成人与其他物种间病毒感染的传播。如何优化培养体系，找到一种既能促进MSCs增殖，又能提供多向分化潜能的优质干细胞，也是满足细胞治疗临床需求的基本条件，研究人员不断探索，努力提高细胞培养血清质量，或探索无血清培养体系等，因而，良好的培养体系的建立是生物技术产业中干细胞体外扩增应用于临床的关键、核心技术。

人脐带血血清(human cord blood serum，hCBS)来源于分娩后的脐带，含有一系列营养因子和细胞因子，来源丰富、易于获取、采集方便，对供者没有损害，无生理和伦理问题，较FBS等动物血清而言，引起动物性疾病在人的传播风险小，可以避免细胞吞噬FBS中的蛋白质及移植时宿主产生免疫反应。hCBS已用于BMSCs和脐带血间充质干细胞的培养，且hCBS在BMSCs的培养扩增中明显优于优等FBS。在hCBS为主体的培养体系中，脐带间充质干细胞可稳定生长，贴壁细胞呈现典型的MSCs特征，细胞呈成纤维细胞样，平行排列生长或旋涡状生长，并可传代扩增。但有关自体hCBS用于hAMSCs培养的研究国内外尚未见报道。

基于hAMSCs的良好临床应用前景，发明人在已建立的胰酶和II型胶原酶消化、分离、纯化和10％FBS LG-DMEM完全培养基培养hAMSCs方法基础上，首次建立自体hCBS培养体系，并观察、分析hCBS培养的hAMSCs的免疫表型、细胞增殖和细胞周期及其多能干细胞标志等，为hAMSCs用于人体细胞治疗提供基本培养技术，可望优先满足自体hAMSCs移植的需要和解决一定规模的hAMSCs细胞产品制备。

发明内容