[发明专利]一种微生物转化制备(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法

权利要求书

1.一种微生物转化制备(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法，其特征在于，所述方法是以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的方法为：以pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液为反应溶剂，以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物、以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25~45 ℃下转化反应12~72小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述底物在反应体系中的初始终浓度为0.1~1 mmol/L。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中还可以添加有终浓度为5~20%的乙醇。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1~20 g/g底物。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含酶菌体细胞按照以下方法制备：将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培养基中，摇床转速为150~200 r/min，26~35 ℃下培养18~30 h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇分离纯化方法如下：反应结束后，将转化液4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的方法按照以下步骤进行：

(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基，26~35 ℃培养4~6天得菌体斜面；

(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，摇床转速为150~200 r/min，26~35℃培养18~26 h得种子液；

(3)发酵培养：取种子液，以体积分数10~20%的接种量接种于发酵培养基中，摇床转速为150~200 r/min，26~35℃培养18~30 h，将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞；

(4)生物转化：在pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液中，添加终浓度为5~20%的乙醇作为辅助底物，加入终浓度为0.1~1 mmol/L的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，以及相当于细胞干重质量为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮1~20倍的含酶菌体细胞，25~45 ℃下转化反应12~72小时，反应结束制得转化液；

(5)分离纯化：转化反应结束后，将转化液于4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：

(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基，26~35℃培养4~6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁5~15 g/L，酵母粉2~4 g/L，蛋白胨4~6 g/L，葡萄糖7~12 g/L，琼脂15~25 g/L，自然pH值，溶剂为水； 

(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26~35 ℃，摇床转速为150~200 r/min，培养18~26 h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：葡萄糖26~32 g/L，酵母粉2~4 g/L，硫酸铵3~6 g/L，无水MgSO₄ 0.2~0.4 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5~1.5 g/L，KH₂PO₄ 0.6~1.5 g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0，溶剂为水；

(3)发酵培养：取种子液，以体积分数为10~20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26~35 ℃，摇床转速为150~200 r/min，培养18~30 h得到含有含酶菌体细胞的发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖26~32 g/L，酵母粉2~4 g/L，硫酸铵3~6 g/L，无水MgSO₄ 0.2~0.4 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5~1.5 g/L，KH₂PO₄ 0.6~1.5 g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0，溶剂为水；

(4)生物转化：在pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为0.1~1 mmol/L的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，添加终浓度为5~20%的乙醇作为辅助底物，以及以相当于细胞干重质量为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮1~20倍的含酶菌体细胞，于25~45 ℃下转化反应12~72小时得转化液；

(5)分离纯化：反应结束后，将转化液于4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。