[发明专利]基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法

权利要求书

1.一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列SNP的分子信标、vent(-exo)DNA聚合酶、耐高温RNase HII和不影响耐高温RNase HII活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用PCR仪进行扩增，定量PCR仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标DNA的SNP类型。

2.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的分子信标的序列为：5’-(FAM)CCGACG X_7-13yX_7-13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中：y表示任意a，u，c，g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的分子信标的全长27-39个核苷酸，嵌合一个核糖核苷酸，分子信标5’端有荧光基团FAM，3’端具有荧光淬灭基团Dabcyl，分子信标5’端6-8个核苷酸与3’端6-8个核苷酸互补配对，使分子信标常温下形成茎环结构，分子信标中间部位嵌合的一个核糖核酸核苷酸与待检SNP位点配对，除了5’端和3’端6-8个核苷酸序列，分子信标其余核苷酸与待测目标序列DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对。

4.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物，其序列分别为：

HLA-A-F：5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’

HLA-A-R：5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’。

5.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的扩增是指：采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链DNA，将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中，利用胶回收试剂盒回收扩增的目标片断；其中的聚合酶链式反应体系由热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测目标DNA模板分子、待测目标DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶组成。

6.根据权利要求1所述的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的荧光强度检测是指：SNP检测反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR。