[发明专利]基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物检测技术领域的方法，具体是一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法。

背景技术

核酸检测和SNP分析已经是一个很大的产业。这些技术不仅在科学研究上获得广泛的应用，在临床诊断、食品检测、法医鉴定等领域的重要性也越来越明显，例如利用SNP可以更好的理解遗传疾病的复杂基础，实现药物治疗[Gene，1999 234，177-186.]。现今的核酸检测和SNP分析技术种类多样，然而目前的方法仍然存在费时费力，通量不高和步骤繁琐等问题[Nat.Rev.Genet，2001，2：930-942；Pharmacogenomics，2000，1：95-100.]，因此SNP检测的高通量与灵敏度，以及简单操作、缩短检测时间目前仍是基因和SNP检测的发展方向。

经过对现有技术的检索发现，Hou J，Liu X，Zheng Y，Liu J.A method for HLA genotyping using the specific cleavage of DNA-rN1-DNA/DNA with RNase HII from Chlamydia pneumoniae Oligonucleotides(利用Chlamydia pneumoniae核糖核酸酶HII酶切DNA-rN1-DNA/DNA底物的特异性检测SNP的方法研究，2007-12-27；Vol 17(4)：433-443)中记载了RNase H是一种特异的内切核糖核酸酶，它能够降解RNA/DNA链中的RNA。目前研究证明RNaseHII能够酶切正确配对的嵌合一个核糖核苷酸的DNA-rN₁-DNA/DNA杂合双链，并且衣原体RNaseHII不能酶切这种错配底物或者酶切效率非常低，因此利用衣原体RNaseHII能够实现对SNP的检测。

最近研究表明耐高温菌的RNase HII具有与衣原体RNaseHII相似的酶切性质，能够酶切正确配对的DNA-rN₁-DNA/DNA底物，不能酶切这种错配底物。另外耐高温菌的RNase HII能够耐受高温，因此在SNP检测方面具备比常温RNaseHII更广泛的应用潜力。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种分子信标，其序列为：5’-(FAM)CCGACG X_7-13yX_7-13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中：y表示任意a，u，c，g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。

所述的分子信标的全长27-39个核苷酸，嵌合一个核糖核苷酸，分子信标5’端有荧光基团FAM，3’端具有荧光淬灭基团Dabcyl。分子信标5’端6-8个核苷酸与3’端6-8个核苷酸互补配对，使分子信标常温下形成茎环结构，荧光基因不能发出荧光。分子信标中间部位嵌合的一个核糖核酸核苷酸与待检SNP位点配对。除了5’端和3’端6-8个核苷酸序列，分子信标其余核苷酸与待测目标序列DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对；

本发明上述分子信标的扩增目标序列的引物，由特异性正向引物和反向引物组成，其序列分别为：

HLA-A-F：5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’

HLA-A-R：5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’。

本发明涉及一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列SNP的分子信标、vent(-exo)DNA聚合酶、耐高温RNase HII和不影响耐高温RNase HII活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用PCR仪进行扩增，定量PCR仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标DNA的SNP类型。