[发明专利]一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法

权利要求书

1.一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于：样品垫(1)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)依次粘附在底板(5)上，金标结合垫(2)放在样品垫(1)上，在上层覆盖PE标签保护膜组装而成；其中金标结合垫(2)上包被有胶体金标记的H-FABP小鼠单抗；硝酸纤维素膜(3)上分别包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线(6)和包被有H-FABP二抗构成的质控线C线(7)。

2.根据权利要求1所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于：所述的金标结合垫(2)上包被胶体金标记的H-FABP小鼠单抗的制备方法如下：

(1)取胶体金溶液，用0.1M碳酸钾溶液调整PH为8.0-9.0，搅拌5min；逐滴加入H-FABP小鼠单抗，继续搅拌30min，加入5％的牛血清白蛋白使其终浓度为1％，搅拌15min，静止1h后，4℃保存备用；

(2)将上述(1)步骤制备的金标H-FABP抗体结合物在12000rpm、4℃条件下，离心30min，弃上清液，沉淀物用含1％BSA、0.02％NaN₃的PB液，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存，将金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥。

3.根据权利要求2所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于：所述的金标结合垫(2)上包被胶体金标记的H-FABP小鼠单抗的制备方法还包括以下步骤：

(3)将上述(2)步骤制备的金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥后，将膜用0.05mol/L PH8.0-9.0的TBS浸洗3次，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入0.05mol/L PH3.0-5.0的柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37℃银染液中20-30min，将膜取出，用去离子水冲洗，放入定影液1min，去离子水冲洗，空气干燥。

4.根据权利要求1所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线(6)是将H-FABP小鼠单抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为检测线T线(6)。

5.根据权利要求1所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有H-FABP二抗构成的质控线C线(7)是将H-FABP二抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为质控线C线(7)。

6.根据权利要求1-5任一所述的一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于：所述的底板(5)是PVC板。

7.一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法，其特征在于：

(一)金标结合垫(2)的制备：

1)胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min-30min，直至颜色变红；室温冷却后加入0.1Mol/L K₂CO₃0.5ml，混匀即得直径约15nm的胶体金颗粒，4℃保存；

2)胶体金与H-FABP小鼠单抗用量比例的确定

a、取10ml胶体金溶液，用0.1M碳酸钾溶液调整PH为8.0-9.0，搅拌5min，分装10管，每管1ml；

b、将H-FABP小鼠单抗以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml-50μg/ml，分别取1ml，加入上述胶体金溶液中，混匀；对照管只加1ml稀释液；

c、5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果；

d、结果观察，对照管和加入H-FABP小鼠单抗的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入H-FABP小鼠单抗量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变；以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低H-FABP小鼠单抗用量，即为H-FABP小鼠单抗的最低用量；

3)胶体金标记H-FABP抗体的制备、纯化

a、取10ml胶体金溶液，用0.1M碳酸钾溶液调整PH为8.0-9.0，搅拌5min；逐滴加入H-FABP小鼠单抗继续搅拌30min，加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，搅拌15min，静止1h后，4℃保存备用；

b、纯化：将上述胶体金H-FABP抗体结合物在12000rpm、4℃条件下，离心30min。弃上清液，沉淀物用含1％BSA、0.02％NaN₃的PB液，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存备用；

4)银染色的处理：将纯化后的金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥后将膜用0.05mol/L PH7.0-9.0TBS浸洗3次，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入0.05mol/L PH3.0-5.0柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37℃的银染液中20-30min，将膜取出，用去离子水冲洗，放入定影液1min，去离子水冲洗，空气干燥，4℃保存备用；即得金标结合垫(2)；

(二)包被检测线T线(6)和质控线C线(7)的硝酸纤维素膜(3)的制备：

将H-FABP小鼠单抗和H-FABP二抗分别喷涂于硝酸纤维素膜(3)上，室温干燥，作为检测线T线(6)和质控线C线(7)，密封，4C保存备用；

(三)试纸的组装：底板(5)从一端依次粘贴样品垫(1)、硝酸纤维素膜(3)，吸收垫(4)，金标结合垫(2)放在样品垫(1)上，然后在上层覆盖PE标签保护膜组装而成。