[发明专利]一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用来快速检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸的制备方法。

背景技术

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常见的心血管疾病，有较高的发病率及病死率。最新的AMI诊断建议是以心肌坏死标志物为基础指标，结合病史、心电图、影像学改变、PCI、冠脉造影、心肌生化标志物的新诊断标准。

心脏型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid binding protein，H-FABP)作为心肌损伤标志物，具有较高的敏感性和特异性，正在逐渐得到临床医生的认可，成为AMI早期诊断的有效指标。

H-FABP是一种可溶性细胞质蛋白，特异地存在于心肌组织中，分子量仅为14～15KD，正常人的血浆和尿中几乎不含有H-FABP。当心肌缺血或受损后，H-FABP被迅速释放入血，并原样从肾脏清除、尿液中排出；H-FABP在血中1.4±0.5h达峰值，在尿中3±0.6h达峰值，可见尿液H FABP与血浆H FABP对早期急性心肌梗塞(AMI)具有同等的诊断价值。

目前临床检测H-FABP的手段，均以血清或血浆为检测样本，采用双抗体夹心ELISA试剂盒等检测方法，检测时间长，采集血样需进行分离处理，易发生溶血现象，不能满足为确定或排除心梗快速提供结果的要求。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过对心脏型脂肪酸结合蛋白的检测技术研究，提供了一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的诊断试纸及其制备方法。该诊断试纸不仅特异性强，灵敏度高，不需要任何的辅助仪器，而且所需检测样品为尿液，方便患者自行取样，具有无创性的优点；同时，检测时间仅需5分钟，为确定或排除心肌梗死提供了方便快捷的方法，为早期治疗争取了宝贵的时间。

本发明的目的是这样实现的：一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸，其特征在于：样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在底板上，金标结合垫放在样品垫上，在上层覆盖PE标签保护膜组装而成；其中金标结合垫上包被有胶体金标记的H-FABP小鼠单抗；硝酸纤维素膜上分别包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线和包被有H-FABP二抗构成的质控线C线。

本发明的目的还可以这样实现：所述的金标结合垫上包被有胶体金标记的H-FABP小鼠单抗的制备方法如下：

所述的金标结合垫上包被胶体金标记的H-FABP小鼠单抗的制备方法如下：

(1)取胶体金溶液，用0.1M碳酸钾溶液调整PH为8.0-9.0，搅拌5min；逐滴加入H-FABP小鼠单抗，继续搅拌30min，加入5％的牛血清白蛋白使其终浓度为1％，搅拌15min，静止1h后，4℃保存备用；

(2)将上述(1)步骤制备的金标H-FABP抗体结合物在12000rpm、4℃条件下，离心30min，弃上清液，沉淀物用含1％BSA、0.02％NaN₃的PB液，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存，将金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥。

(3)将上述(2)步骤制备的金标H-FABP抗体结合物喷涂于玻璃纤维膜上，室温干燥后，将膜用0.05mol/L PH8.0-9.0的TBS浸洗3次，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入0.05mol/L PH3.0-5.0的柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入37℃银染液中20-30min，将膜取出，用去离子水冲洗，放入定影液1min，去离子水冲洗，空气干燥。

所述的硝酸纤维素膜上包被有H-FABP小鼠单抗构成的检测线T线是将H-FABP小鼠单抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为检测线T线。

所述的硝酸纤维素膜上包被有H-FABP二抗构成的质控线C线是将H-FABP二抗喷涂于硝酸纤维素膜上，室温干燥后作为质控线C线。

所述的底板是PVC板。

本发明一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试纸的制备方法，其特征在于：

(一)金标结合垫的制备：

1)胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min-30min，直至颜色变红；室温冷却后加入0.1Mol/L K₂CO₃0.5ml，混匀即得直径约15nm的胶体金颗粒，4℃保存；

2)胶体金与H-FABP小鼠单抗用量比例的确定