[发明专利]一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法

说明书

技术领域

本发明属于棉花抗病育种技术领域，涉及一种离体叶片鉴定法鉴定植物病害技术领域。本发明具体涉及一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法，为作物抗病育种提供抗性材料的早期快速鉴定。 

背景技术

棉花黄萎病是棉花最重要的病害之一，危害严重，而且棉花黄萎病菌致病力变异性强，在与寄主协同进化的过程中，由于病菌异核现象和生态环境差异的影响，常出现生理分化，出现新的致病类型，因此摸清我国主要植棉区棉花黄萎病的致病力分化情况，寻求一种快速准确的棉花抗黄萎病鉴定技术是当今棉花抗病育种的迫切要求，对我国棉花的可持续发展有着重要的意义。 

张兴华，田绍仁等人在棉花抗棉铃虫室内生物学测定中对棉叶活力保鲜技术进行了研究，采用透明的聚丙烯塑料盒内填聚氨酯人造海绵加水做培养基，不仅保鲜而且能保持棉叶的生命活力，而且保证了棉铃虫抗性测定的准确性(马丽华，李春花，棉花抗棉铃虫性室内生物测定新方法，中国棉花，实用技术，1998，25(7)：27-36)受此启发，以棉叶保鲜技术为基础对棉花抗黄萎病鉴定技术进行了探索，以试探是否可以通过离体叶片接菌的方式进行抗病鉴定。笔者称之为离体叶片鉴定法，即在大田中，取棉株果枝上的成熟叶片，经消毒、清洗以及干燥后，叶柄蘸菌，在保鲜盒中离体培养并观察棉苗发病情况的一种棉花抗黄萎病鉴定方法。通过此方法，不仅可以同时测定多个菌系对同一单株的致病力情况，而且能够进行抗性遗传的相关研究，在棉花育种单位具有应用推广价值。因此，一旦此方法成熟，将作为一种快速、准确的鉴定技术应用于棉花黄萎病鉴定中。 

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种快速、简便和灵敏度高的离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法。 

本发明的技术方案如下： 

一种离体叶片鉴定棉花黄萎病的方法，包括如下步骤： 

1)将冰箱中试管保存的保藏号为CCTCC NO：M2011095的大丽轮枝菌6SY2-37转移至盛有PDA培养基的培养皿中，之后将培养皿放在恒温箱中进行活化，活化温度为25℃，活化时间为10-15d，取一直径约4mm的菌块放入盛有50ml Czapek’s培养基的三角瓶中，于25℃下 振荡培养5-6d； 

2)将步骤1)的病菌培养物用双层纱布过滤，在显微镜下用血球计数板统计孢子数，用无菌水将孢子调至5×10⁶个/ml的孢子悬浮液； 

3)透明的聚乙烯保鲜盒经浓度75％的酒精消毒后，用无菌水冲洗2次，然后放入已裁剪好的海绵加水作为培养基； 

4)从大田取棉株果枝上的成熟叶片作为外植体，在超净工作台上用浓度75％的酒精消毒，无菌水冲洗3-4次，然后放在灭菌的滤纸上，待水分被吸干后，叶柄蘸菌，浸入保藏号为CCTCC NO：M2011095的大丽轮枝菌6SY2-37，菌液浓度为5×10⁶个/ml的大丽轮枝菌6SY2-37孢子悬浮液中1-2s后立即取出，直立插入海绵切口处，叶间距为2-3cm，最后放置在25℃条件下的温室中进行离体培养，10d后观察棉花叶片发病情况。 

其中： 

步骤1)中所述的Czapek’s培养基配方为：FeSO₄0.02g/L，NaNO₃2g/L，MgSO₄1g/L，KCl1g/L，KH₂PO₄1g/L，蔗糖30g/L；pH6.0；补充蒸馏水至1L。 

申请人从湖北省沙洋县感染棉花黄萎病的棉株上分离得到一株专用于离体叶片鉴定棉花黄萎病的大丽轮枝菌6SY2-37(Verticillium dahliae 6SY2-37)，于2011年3月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011095。 

本发明的其中一个优点是：利用本发明的保鲜盒中进行叶片离体培养时，盒底部的海绵吸足了水分，为叶片根系的正常发育提供了充足的水分，也为叶片发病提供了适宜的湿度。另外，保鲜盒为透明的聚乙烯盒，叶片在其内部可以得到充足的光照，保证了叶片能正常进行光合作用，进而产生养分为棉叶自身提供生命动力，所以叶片能长时间保鲜，保鲜时间可达到30d以上，保鲜时间超过了抗病鉴定所需时间(一般15-20d)，为离体叶片抗病鉴定奠定了基础，因此可用此法进行抗病材料的早期快速鉴定。