[发明专利]一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物物种的分子鉴定方法，特别涉及一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法。

背景技术

蔗扁蛾Opogona sacchari (Bojer)为我国新增检疫性有害生物，该虫在欧洲地区植物保护组织(EPPO)、亚太地区植物保护组织(APPO)和北美地区植物保护组织(NAPPO)等地区也被列为检疫性昆虫。1997年首次在北京园林植物中发现。该虫寄主广泛，已报道的有24科46种；可危害香蕉、甘蔗、巴西木Dracaena fragrana (L.)、发财树Pachira macrocarpa等园林植物。据报道，蔗扁蛾最早在毛里求斯发现，然后其附近的马达加斯加及北部的塞舌尔群岛相继发现该虫。不久，该虫又传入南非。1928年，大西洋上的加纳利(Canary)群岛开始出现蔗扁蛾，1972年传入荷兰, 1974年传入英国和意大利。1975年在南美首次发现蔗扁蛾，并在巴西的圣保罗定殖。20世纪80年代末，蔗扁蛾在北美有分布报道，目前在美国的佛罗里达州和夏威夷群岛已有分布。此外，日本和印度也相继发现该虫。说明该虫的适生范围广，定殖能力强。

扁蛾属(Opogona Zeller, 1853)与其近缘种类在外形上很类似，单纯依靠外部形态对其进行种类鉴定比较困难。依靠形态学鉴定要求检验人员需具备非常专业的技术，而一线检验鉴定人员大部分不具备这样的技术要求。此外，形态学鉴定对虫态的要求比较高，这无形中也增加了其检疫难度。

CN 101787394A公开了通过扩增蔗扁蛾线粒体基因组中的COI基因，并将其导入E.coli中克隆纯化，之后筛选得到高效表达蔗扁蛾的特征、蔗扁蛾复合种的种间差异的基因或基因片段，设计蔗扁蛾特异性引物CF720和CR1113，通过判断扩增特异性片断的存在情况确定检疫结果。这种方法操作难度大，很难获得足够的COI基因，后续的分析也会耗费大量的时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA，制备模板DNA，-20℃保存备用；

取上游扩增引物ITSTF402：5'-CTCCAACCGCCGCCTCCTCCTCAGT-3'和下游引物ITSTR596：5'-CCAAGTCGCATCCGTGACGGTTCG-3'及探针ITS194TM：5'-FAM-GAACCGCACCCGAGCGCGAGACG-TAMRA-3'、Premix Ex Taq和ddH₂O，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系，反应体系的总体积为25μl，各成分组成如下：12.5μl Premix Ex Taq(2×)、上、下游引物各0.75μl，浓度为10pmol/μl，5.5μl的ddH₂O，0.5μl的探针，其浓度为10pmol/μl；5μl模板DNA；

PCR反应条件为：95℃ 3min预变性，95℃10s，60℃ 30s，循环45次；

读取Ct值判断检测结果。

本发明方法，克服了传统形态学检测的局限，实现了对蔗扁蛾的快速、准确和稳定的检测。同时，本发明的检出限低，可以检出0.1pg/μl浓度的样品，可以更为准确地检测出样品蔗扁蛾的种类。本发明方法，还可以用于扁蛾属的分类和近缘种的快速鉴定，适用于不同虫态的检测。有助于保护我国农林生产安全、维持生态平衡，保证公共卫生安全。

附图说明

图1是不同样品的实时荧光PCR检测图。

具体实施方式