[发明专利]一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种工程菌的构建方法，包括如下步骤：将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，得到的重组菌即为所述工程菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述次级醇脱氢酶是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白质：将丙酮催化成异丙醇。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述次级醇脱氢酶的编码基因为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述次级醇脱氢酶的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述次级醇脱氢酶的DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，通过下述任一种方法实现：同源重组法、二型内含子整合法、特异位点整合法和随机位点整合法。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，通过将所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到所述产丁醇梭菌的染色体中的如下位点实现：尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因位点或16SrDNA位点。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述产丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，通过将如下片段导入所述产丁醇梭菌中实现：由所述次级醇脱氢酶的编码基因和启动所述次级醇脱氢酶的编码基因转录的启动子组成的DNA片段；所述启动子具体可为丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子；所述丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子的序列具体可为序列表中序列2或序列8的第287至436位；

由所述次级醇脱氢酶的编码基因和启动所述次级醇脱氢酶的编码基因转录的启动子组成的DNA片段的核苷酸序列具体可为序列8的第287-1498位。

8.权利要求1-7中任一所述的方法得到的工程菌。

9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为下述a或b或c所述的重组菌：

a、将pEK18-upp(8052)-sadh导入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因组中的重组菌；

b、将pEK18-16S(8052)-sadh导入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因组中的重组菌；

c、将pMTL009-upp-sadh导入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB009，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到丙酮丁醇梭菌SMB009的基因组中的重组菌，如保藏号为CGMCC No.4724的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB312。

10.权利要求9所述的工程菌在生产醇中的应用，所述醇为下述三种醇中的至少一种：丁醇、异丙醇和乙醇。