[发明专利]一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

随着能源与环境危机的日益加重，迫使人们去寻找新的方法来逐步减少对于化石资源的依赖。通过微生物利用可再生资源来生产化学品是重要的途径之一。

异丙醇(isopropanol)是重要的化工产品和原料。主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料及电子工业上用作脱水剂及清洗剂。异丙醇作为低成本溶剂或萃取剂在工业和消费产品中的生产中广泛应用。低品质的异丙醇还可用在汽车燃料中。在许多情况下异丙醇可代替乙醇使用。2010年我国对异丙醇的年需求总量将达到30万吨，我国异丙醇主要用作油墨、涂料和制药工业过程中的溶剂或萃取剂，其消费量约占异丙醇总消费量的60％。在化学中间体领域，我国异丙醇主要用于生产异丙胺、异丙醚以及一些酯类，其消费量约占异丙醇总消费量的25％。异丙醇在其他方面的应用主要包括电子工业清洗剂、汽车防冻液、消毒剂、洗涤用品、日化产品等，其消费量约占异丙醇总消费量的15％。

丁醇是一种优良的可替代汽油的生物燃料，这是因为丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合，因此是一种极具潜力的新型生物燃料。同时丁醇还是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，是一种高附加值化学品，全球年需求量超过140万吨。

1861年巴斯德首次发现细菌能够产生丁醇，1912年魏兹曼(Weizmann)发现了一种梭菌Clostridium acetobutylicum能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。有研究发现拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593和NESTE 255可以在细胞内合成大约100mM的异丙醇，其合成机理是通过一种异丙醇醇脱氢酶(又称次级醇脱氢酶，secondary alcohol dehydregenase，SADH)将丙酮催化成异丙醇。

发明内容

本发明的目的是提供一种联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用。

本发明所提供的工程菌，按照包括如下步骤的方法构建：将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)整合到产丁醇梭菌的基因组中，得到的重组菌即为所述工程菌。该方法使得次级醇脱氢酶的编码基因能够随着染色体的复制而复制，实现稳定表达。

所述次级醇脱氢酶具体可为如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白质：将丙酮催化成异丙醇。

所述次级醇脱氢酶的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述次级醇脱氢酶的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述次级醇脱氢酶的DNA分子。

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，可通过下述任一种方法实现：同源重组法、二型内含子整合法、特异位点整合法和随机位点整合法。但不限于这几种方法，包括任何可以在基因组中进行整合外源基因的方法。

所述同源重组方法包括使用自杀载体进行重组，也包括使用复制性质粒和线性DNA片段进行的重组方式。

所述同源重组方法的整合位点是指染色体任何可以插入外源片段的位点。

所述二型内含子整合法具体可为通过Ll.ltrB二型内含子的方法插入到产丁醇梭菌的基因组中。其中，插入位点是指产丁醇梭菌基因组中任何可以允许插入的DNA位点。

所述特异位点整合法是将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)通过特异位点的重组酶的帮助插入到产丁醇梭菌的基因组中。

所述随机位点整合法是将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)通过以随机方式整合到产丁醇梭菌的基因组中。所述随机方式整合包括转座子和噬菌体等机制的外源DNA整合到产丁醇梭菌基因组的方式。