[发明专利]检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒，尤指多重RT-PCR检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检测核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于对动物组织样本的准确检测，还可适用于动物活体样本（咽喉拭子、肛门拭子、粪便、血清、疱疹皮、疱疹液、眼结膜分泌物等）的检测，可用于牛肠道病毒的国内筛查和出入境检疫，以及牛肠道病毒和口蹄疫病毒的同时检测和鉴别诊断等，属于动物疫病检测、检验检疫领域。

背景技术

牛肠道病毒和口蹄疫病毒都是小RNA病毒科成员。小RNA病毒是一个极为繁杂的病毒科，可分为鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属等5个属，共200多种病毒，能引起人和动物的多种疾病，如甲肝、口蹄疫等，在医学和兽医学研究中均具有重大意义。

肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，病原性不明显，通常引起轻度或不显性感染，但常因侵犯其他器官而引起各种临床综合征，或者在一定条件下引发显著症状，例如牛肠道病毒、猪肠道病毒、禽肠道病毒、人肠道病毒等等。

2005年初北京的牛场中发生牛肠道病毒感染，严重影响了畜牧业生产。部分牛场的产奶牛普遍（约80%）出现了严重腹泻症状：水样腹泻，有泡沫，少数（10-15%）严重的还有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降（约30%）。约两周后康复，康复后大多数奶牛的产奶量不能恢复到病前的水平，特别是日产35千克以上高产奶牛。严重降低了生产性能，并且还有污染奶制品的可能。据跟踪调查，该病两年发生一次。我们在发病的牛场中已经分离到了牛肠道病毒。

随着猪链球菌2型病和高致病性蓝耳病的相继爆发，条件性致病菌／病毒对畜牧业生产和公共卫生安全方面的威胁，或者说潜在的危险也逐渐为人们所认识。因此我们认为随着人们对牛肠道病毒认识的加深和对公共卫生安全的重视日益加强，牛肠道病毒很有可能在将来被列为法检项目，在这种情况下我们提前针对牛肠道病毒建立快速、准确、敏感的诊断方法，进行技术储备显得格外重要，因此开展了牛肠道病毒快速检测技术研究。

口蹄疫病毒可以感染偶蹄动物引起急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等，黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。本病以牛最易感染，羊的感染率低。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”。

牛肠道病毒与口蹄疫病毒同属于小RNA病毒科成员，在形态结构、化学组成、部分理化性质和对环境的抵抗力方面有很多相近之处，而国外研究报道了多起牛肠道病毒与口蹄疫病毒同时分离到的病例，因此针对牛肠道病毒和口蹄疫病毒建立鉴别诊断方法也具有重大意义。

在检验检疫过程中，快速、准确、敏感的诊断是检测疫病的关键所在。多重PCR可以同时区别鉴定两种或两种以上的病原，操作也比较简单易行，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，适用于多种病原的鉴别诊断。

因此我们针对牛肠道病毒基因和口蹄疫病毒基因建立多重RT-PCR快速检测技术，用于牛肠道病毒和口蹄疫病毒的鉴别诊断。这种检测方法的建立将为我国出入境牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检验检疫奠定良好的技术基础，可在各口岸和各养殖企业推广应用，以及时检出牛肠道病毒和口蹄疫病毒，保障公共卫生安全，保障我国牛及其产品进出口贸易的正常进行，推动外贸经济的发展。

一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。