[发明专利]一种实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种可以精确、特异、快速检测CSFV的方法。

背景技术

猪瘟(swine fever，SF)，又称猪霍乱(hog cholera，HC)、烂肠瘟，在欧洲则被称为古典猪瘟(classical swine fever，CSF)，是世界上养猪业的一种重要的传染病，一度给养猪业带来了严重的经济损失。

对于CSF的传统诊断方式主要有动物试验、免疫荧光试验、血清中和试验、ELISA、单克隆抗体试验。动物试验是检测猪瘟病毒的敏感方法，但是检测时间较长且目前存在流行的猪瘟病毒大多为低毒力病毒株即使接种也不呈现出典型猪瘟症状；免疫荧光试验方法较为特异，但是在实际检测应用过程中此项技术要求具有荧光抗体、荧光显微镜以及检验者较高的检测技术；血清中和试验和ELISA试验除检测时间较长外，均难以鉴别疫苗抗体和感染后产生的抗体，很容易出现假阳性；单克隆抗体技术特异性较强，但是操作起来过程复杂，成本较高，不适应于大批量样品诊断的要求。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，旨在解决现有技术中所存在的问题。

本发明的技术方案如下：

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性引物，其中，CSFV特异性引物序列如SEQ NO.1-2所示。

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性探针，其中，CSFV特异性探针序列如SEQ NO.3所示。

根据权利要求2所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性探针，其中，所述CSFV特异性探针的5′端标记发光基团FAM，3′端标记泯灭基团BHQ1。

一种使用上述的特异性引物和特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，其中，包括以下步骤：

S100、样品的预处理：对采集的样品分别进行编号，在样品中加适量青、链霉素双抗溶液， 匀浆，取上清，4℃过夜；

S200、RNA提取：对采集的样品提取RNA；

S300、CSFV的实时荧光定量RT-PCR反应：以上述步骤所提取的RNA为模板，加入CSFV的特异性引物和特异性探针，使用TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒进行PCR扩增；S400、根据CSFV实时荧光定量RT-PCR反应结果，鉴定样品中是否含有CSFV。

5、根据权利要求4所述的实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的方法，其特征在于，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25μL，每条特异性引物终浓度为0.2μmol/L，特异性探针浓度为0.1μmol/L；

反应条件为42℃30min，92℃2min，92℃10s，55℃30s，40个循环。

有益效果：本发明在ABI 7500 fast real-time PCR仪的基础上建立了快速、灵敏、特异检测CSFV的荧光RT-PCR方法。经过对本发明所建立的方法进行了特异性、灵敏度的验证，结果显示本方法可以较好的将CSFV同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒和2型猪圆环病毒区分开，且灵敏度可以达到10拷贝数的数量级。另外，本发明所建立的方法整个反应过程是闭管操作，在最大程度上减少了体系的污染。本发明在诊断时间上同传统方法相比自获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2.5h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。

附图说明

图1是实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的灵敏度试验结果曲线图，从左到右的曲线的稀释倍数依次是：10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10。

图2是实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的特异性扩增荧光曲线。

图3是本发明实施例1中实时荧光定量RT-PCR检测CSFV的结果图。

具体实施方式

本发明提供一种实时荧光定量定量RT-PCR检测CSFV的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。