[发明专利]一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法无效
| 申请号： | 201110084991.2 | 申请日： | 2011-04-06 |
| 公开（公告）号： | CN102220436A | 公开（公告）日： | 2011-10-19 |
| 发明（设计）人： | 罗宝正;王振全;薄清如;沙才华;徐海聂;廖秀云;陈伟生;李红星 | 申请（专利权）人： | 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州三环专利代理有限公司 44202 | 代理人： | 温旭 |
| 地址： | 519015 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 实时 荧光 定量 rt pcr 检测 fmdv 方法 | ||
1.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性引物，其特征在于，FMDV群特异性引物序列如SEQ NO.1-2所示；FMDV O型特异性引物序列如SEQ NO.4-5所示；FMDV AsiaⅠ型特异性引物序列如SEQ NO.7-8所示。
2.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其特征在于，FMDV群特异性探针序列如SEQ NO.3所示；FMDV O型特异性探针序列如SEQ NO.6所示；FMDV AsiaⅠ型特异性探针序列如SEQ NO.9所示。
3.根据权利要求2所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其特征在于，所述FMDV群特异性探针、FMDV O型特异性探针和FMDV AsiaⅠ型特异性探针的5'端都标记发光基团FAM，3'端都标记泯灭基团TAMRA。
4.一种使用如权利要求1所述的特异性引物和如权利要求2所述的特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜；
S200、RNA提取：对采集的样品提取RNA；
S300、FMDV 实时荧光定量RT-PCR扩增：以上述步骤所提取的RNA为模板，分别使用FMDV群、O型、AsiaⅠ型的特异性引物、特异性探针进行PCR扩增；
S400、根据实时荧光定量RT-PCR反应结果鉴定诊断是否含有FMDV，并判断是否为O型或AsiaⅠ型FMDV。
5.根据权利要求4所述的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其特征在于，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游特异性引物和特异性探针各1.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：1.0 μL，RNA模板2.5 μL，RNase Free H2O 6.0μL；
反应条件为42℃ 30 min，92℃ 2min，92℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环。
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