[发明专利]一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种可以精确、特异、快速检测口蹄疫病毒群特异性、O型特异性、AsiaⅠ特异性的方法。 

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由FMDV（Foot and mouth disease virus）感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性和接触性传染病。由于该病发病迅速，传染性较强可能带来严重的影响，因此世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类疫病。该病一经检出，相应的家畜及畜产品就禁止运输和出口，造成巨大的经济和政治影响。我国于2005年对外公布了AsiaⅠ型FMD 疫情，加上以前报道FMD，已经有2个血清型的口蹄疫疫情在国内出现过。FMD 的爆发和流行除了对畜牧业生产造成巨大的损失外，对人民生活所需要的奶品、肉品供应也造成很大的影响，故各国对 FMD的检验检疫非常严格。 

目前对于口蹄疫病毒的检测方法主要有：病毒分离、补体结合实验（CFT）、病毒中和试验（VNT）、动物接种试验及ELISA方法。这些方法操作起来过程繁琐且需时较长，特异性和灵敏度也无法满足目前检测需要。在病毒分离试验中培养细胞过程尤为细心谨慎以控制污染，而且病毒材料的致病力以及对于细胞适应性有区别，细菌和霉形体也会对细胞造成污染，因此获得的实验结果往往出现差异。 

因此，现有技术还有待于改进和发展。 

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，旨在解决现有技术中所存在的问题。 

本发明的技术方案如下： 

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性引物，其中，FMDV群特异性引物序列如SEQ NO.1-2所示；FMDV O型特异性引物序列如SEQ NO.4-5所示；FMDV AsiaⅠ型特异性引物序列如SEQ NO.7-8所示。

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其中，FMDV群特异性探针序列如SEQ NO.3所示；FMDV O型特异性探针序列如SEQ NO.6所示；FMDV AsiaⅠ型特异性探针序列如SEQ NO.9所示。 

所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测FMDV群及其O型、AsiaⅠ型的特异性探针，其中，所述FMDV群特异性探针、FMDV O型特异性探针和FMDV AsiaⅠ型特异性探针的5'端都标记发光基团FAM，3'端都标记泯灭基团TAMRA。 

一种使用上述的特异性引物和特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其中，包括以下步骤： 

S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜；

S200、RNA提取：对采集的样品提取RNA；

S300、FMDV实时荧光定量RT-PCR扩增：以上述步骤所提取的RNA为模板，分别使用FMDV群、O型、AsiaⅠ型的特异性引物、特异性探针进行PCR扩增；

S400、根据实时荧光定量RT-PCR反应结果鉴定诊断是否含有FMDV，并判断是否为O型或AsiaⅠ型FMDV。

所述的实时荧光定量RT-PCR检测FMDV的方法，其中，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游特异性引物和特异性探针各1.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：1.0 μL，RNA模板2.5 μL，RNase Free H₂O 6.0μL； 

反应条件为42℃ 30 min，92℃  2min，92℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环。

有益效果：本发明利用实时荧光定量RT-PCR技术可以对FMDV进行种属性、O型和AsiaⅠ型的检测。经过对本发明所建立的方法进行了特异性、灵敏度的验证，结果显示可以较好的将FMDV同偶蹄目其他易感病毒以及O型和AsiaⅠ型区分开，且灵敏度可以达到10个拷贝数的模板用量。同传统病毒分离实验相比较，如果针对分离的FMDV不适应细胞培养时，本发明方法更加显示出其优越性，而且需要极少的样品即可检测。另外，本发明所建立的方法整个反应过程是闭管操作，在最大程度上减少了体系的污染。从获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2.5h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。