[发明专利]重组人凝血因子IX小基因及其PTC突变体稳定细胞株

权利要求书

1.一种重组人凝血因子IX小基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.一种重组人凝血因子IX小基因PTC突变体，其是由权利要求1所述的重组人凝血因子IX小基因通过PCR定点突变技术将其核苷酸序列中3092位由g突变为t。

3.一种稳定细胞株，其含有权利要求1所述的重组人凝血因子IX小基因。

4.一种稳定细胞株，其含有权利要求2所述的重组人凝血因子IX小基因PTC突变体。

5.一种稳定细胞株的建立方法，包括如下步骤：

1)利用基因重组技术将人凝血因子IX小基因(mini hF9A)克隆入哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B中，构建成pCMV-Tag3B-mini hF9A，重组质粒经酶切鉴定；

2)利用PCR快速定点突变方法，得到3092位由g突变为t，人凝血因子IX小基因的PTC突变质粒pCMV-Tag3B-mini hF9A-N；

3)培养人肝癌细胞HepG2，培养液为DMEM，添加10％胎牛血清，不添加任何抗生素培养，胰酶消化细胞，按2×10⁵cell/mL密度种于6孔板；

4)利用脂质体LipofectamineTM 2000将质粒pCMV-Tag3B-mini hF9A和pCMV-Tag3B-minihF9A-N分别转染HepG2细胞，转染24小时后，胰酶消化细胞，按1∶10稀释接种于6孔板，加G418(500μg/mL)筛选，每3～5天更换一次含有G418的筛选培养液；

5)筛选3周左右，6孔板出现阳性细胞簇，显微镜下挑取细胞簇，采用有限稀释法在96孔板中进行单克隆化；

6)96孔板中单细胞增殖过程中，用胰酶消化吹散使其重新贴壁生长，待长至80％以上，进行传代培养，并通过RT-PCR进行鉴定；

7)对于RT-PCR鉴定阳性克隆，扩大培养，提取基因组，进行PCR鉴定，最终获得两种细胞稳定株HepG2-WT和HepG2-N；

8)将两种细胞稳定株HepG2-WT和HepG2-N冻于液氮中保藏。