[发明专利]重组人凝血因子IX小基因及其PTC突变体稳定细胞株

说明书

技术领域：

本发明涉及分子生物学和细胞生物学，基因工程和细胞工程技术，具体涉及一种重组人凝血因子IX小基因及其PTC突变体稳定细胞株的建立方法和依照该方法建立的重组人凝血因子IX小基因及其PTC突变体稳定细胞株。

背景技术：

血友病(haemophilia)是一种X染色体连锁隐性遗传性疾病。分为HA、HB两型，分别是由于编码凝血因子VIII(F8)和凝血因子IX(F9)基因突变引起的血液中两个因子的活性降低或含量减少导致的先天性凝血机制障碍性疾病。社会人群发病率5-10/10万，婴儿发病率约1/5000，属于高发病性遗传疾病。在血友病患者中约有80％为重型。血友病目前仍没有理想的治疗方案，以替代疗法为主，输注新鲜血浆、从血浆中提取的或基因工程制备的凝血因子，治疗费用昂贵，而且输注后有可能产生抗体，给血友病患者及其家庭造成了沉重的经济负担和心理压力。

对血友病数据网站(http://europium.csc.mrc.ac.uk，HAMSTeRS database和http://www.kcl.ac.uk)登记的突变基因序列分析结果显示，血友病的凝血因子缺陷主要是错义或无义、删除或插入突变导致。对于F8因子基因，在26个外显子中共有781个突变位点，其中无义突变达到了145，占到总突变的18.6％，无义突变发生的热点区域位于第14个外显子的719-1709，共有56个无义密码子出现；对于F9因子基因，630已报道的点突变中，70个为无义突变，占到突变总数的11.1％。基因无义突变后由于产生PTC，很有可能引发机体mRNA检测系统NMD途径的发生，从而降解这种含有PTC的mRNA，进而导致其蛋白水平很低。

目前基因内PTC的通读和NMD途径机制研究是分子细胞生物学的热点之一，对由此导致的遗传疾病的治疗具有潜在应用价值。研究表明在体外，氨基糖甙类(gentamicine和geneticine)化合物能够结合到核糖体的识别中心(decoding center)，降低密码子和反密码子配对的准确性，引起mRNA中密码子的错读，在培养的动物细胞和人体细胞中都得到了实验的证实。对NMD途径的抑制与药物促PTC通读表达已经用于基因无义突变导致的癌症、肿瘤和部分遗传疾病的机理研究，并且取得了长足的进展，取得了一系列有意义的分子学数据和试验结果。目前国内外尚无一细胞株可用于由于无义突变导致的血友病的药物筛选，因此急需建立相应的细胞株供体外筛选由于无义突变导致的血友病的潜在药物，更可用于筛选由于无义突变引发的遗传性疾病的临床治疗药物。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种重组人凝血因子IX小基因及其PTC突变体的稳定细胞株，该稳定细胞株可以用于体外筛选由于无义突变导致的血友病及其他遗传性疾病的临床治疗药物。

本发明提供的一种重组人凝血因子IX小基因，含有外显子1+部分内含子1(699bp)、部分内含子5+外显子6+部分内含子6(2115bp)、部分内含子6+外显子7+内含子7+外显子8+HA标签(1536bp)；其中7～124、1599～1801、3059～3173、3842～4371位为外显子，4372～4401位为HA标签序列；其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明提供的一种重组人凝血因子IX小基因PTC突变体，其是由所述的重组人凝血因子IX小基因通过PCR定点突变技术将其核苷酸序列中3092位由g突变为t。

本发明提供的一种稳定细胞株，其含有上述重组人凝血因子IX小基因。

本发明提供的一种稳定细胞株，其含有上述重组人凝血因子IX小基因PTC突变体。

本发明提供的一种稳定细胞株的建立方法，包括如下步骤：

1)利用基因重组技术将人凝血因子IX小基因(mini hF9A)克隆入哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B中，构建成pCMV-Tag3B-mini hF9A，重组质粒经酶切鉴定；

2)利用PCR快速定点突变方法，得到3092位由g突变为t，人凝血因子IX小基因的PTC突变质粒pCMV-Tag3B-mini hF9A-N；

3)培养人肝癌细胞HepG2，培养液为DMEM，添加10％胎牛血清，不添加任何抗生素培养，胰酶消化细胞，按2×10⁵cell/mL密度种于6孔板；