[发明专利]利用锌指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法

权利要求书

1.一种利用锌指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)根据牛β-乳球蛋白基因序列，设计ZFNs-Set 1和ZFNs-Set 2，其作用的DNA序列分别为：

ZFNs-Set 1：CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA；

ZFNs-Set 2：AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATAT；

2)构建ZFNs-Set 1和ZFNs-Set 2的真核表达载体；

3)将上述真核表达载体分别转入牛的成纤维细胞中，PCR扩增，测序检测β-乳球蛋白基因发生敲除的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述真核表达载体是pBudCE-ZFN1-2，它的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

3.通过权利要求1或2所述的方法获得的基因敲除细胞。

4.权利要求1或2所述的方法在生产基因敲除克隆牛中的应用。

5.一种制备β-乳球蛋白基因敲除的牛克隆胚胎的方法，其以权利要求3所述的基因敲除细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得牛克隆胚胎。

6.一种制备转基因牛的方法，其是将权利要求5所述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入牛子宫内进行妊娠，获得转基因牛。