[发明专利]利用锌指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用锌指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法。

背景技术

基因打靶技术是一种定向改变生物体遗传信息的技术，常规基因打靶动物生产的两大限制因素为：第一，动物体细胞基因打靶效率很低，10^-6～10^-7；第二，生产双等位基因敲除的动物时间周期长，克隆效率低。伴随着分子生物学的不断发展，涌现出很多新的技术和方法来提高基因打靶效率，如采用无启动子筛选的基因打靶策略，动物中干细胞的分离及诱导等。但是这些改进对于生产基因打靶动物并没有显著的推动作用，所以基因打靶动物的生产一直处于缓慢发展阶段。最近几年，锌指蛋白核酸酶(ZFNs)的出现极大地提高了基因打靶的效率，其将成为生产基因敲除动物的一个重要的突破口。

牛奶过敏(cow’s milk allergy)是小儿最常见的食物过敏类型之一，在许多欧美发达国家，婴儿牛奶过敏发生率约为2％～3％。牛奶过敏是指机体对牛奶蛋白的高反应性(hypersensitivity)。牛奶中含有多种蛋白质，其中，α-S1酪蛋白和β-乳球蛋白是引起牛奶过敏的主要过敏源。

β-乳球蛋白是反刍动物如牛、羊和单胃动物如猪、马、猫乳中的主要乳清蛋白，人类和啮齿类中基本不存在该蛋白(Kontopidis等，2004，J.Dairy Sci.87：785-796)。β-乳球蛋白具有凝聚能力和疏水性，一方面可以作为食品添加剂，用于甜点、调味料和涂抹性食品中；另一方面，β-乳球蛋白具有较强的视黄醇结合能力和脂肪酸结合能力，可以用来包含脂溶性维生素用于乳制品、焙烤食品、运动饮料和营养增补剂。利用β-乳球蛋白的热还原性，还可以模拟和代替无脂食品中的动物油，或者将改良的β-乳球蛋白应用于酸奶中，可使普通酸奶的成胶性提高6-10倍。

然而β-乳球蛋白功能的研究报道还较少，尤其是在牛乳中营养功能的研究方面鲜有报道。此外，该蛋白在牛奶中的低量表达或者不表达对于牛奶过敏是一种有利的缓解措施。通过基因打靶技术，将该基因失活，是研究其功能和缓解牛奶过敏的一个理想的手段。

锌指蛋白核酸酶(ZFNs)融合了DNA调控元件特异性的结合DNA的特性以及内切核酸酶的催化活性，N末端的锌指蛋白能够特异的结合DNA序列，通过C末端内切核酸酶FokI的催化作用，使得DNA双链分子产生断裂(DSB)，紧接着DSB就会启动细胞内自身修复机制。目前主要的修复机制有两种：一种是非同源重组的末端连接修复机制，另一种是同源重组修复机制。前一种修复机制是一种易错修复常常会产生遗传信息的改变，而利用同源重组修复机制来修复DSB是一种高保真的修复方式，一般以另一条姐妹染色体为模板进行精确修复。在哺乳动物细胞内，前一种修复机制占主导作用，借助ZFNs特异性产生DSB，引发细胞非同源重组的末端连接修复，在DSB位点引入小片段删除，或者插入，造成移码突变，或者蛋白关键序列的缺失达到基因敲除目的(图1)。

应用ZFNs介导基因敲除或者修饰在斑马鱼，拟南芥等模式生物中已经成功实现，并且效率较高10～50％(Doyon，Y等，Nat.Biotech.2008，26：702-708；Lloyd，A等，PNAS 2005，102：2232-2237)。本发明证实了利用ZFNs在动物体细胞内进行基因的删除或者精细修饰是一种行之有效的方法，能够成功获得基因敲除克隆牛。

常规基因打靶克隆牛的生产流程，包括构建基因打靶载体，载体转染，细胞药物筛选，细胞单克隆的鉴定，体细胞核移植，克隆牛的鉴定。如果需要对第二个等位基因也进行敲除，需要经历上述同样的过程，即需要进行两次细胞克隆，并且最后得到的克隆牛含有药物筛选时所必须的抗性基因，最后要得到不含有抗性基因的动物个体还要经历一次体细胞克隆。以牛为例完成上述过程需要的时间为：载体构建3个月，细胞筛选1个月，体细胞核移植、胚胎发育1个月，胚胎移植妊娠到小牛出生10个月。这样，一次克隆至少需要14个月的时间。并且在细胞筛选过程中，有些甚至无法得到阳性单细胞克隆。如果实现无抗性基因的基因敲除牛需要进行三次克隆，则所需时间就至少需要42个月，周期长、风险高。而本研究证明，利用ZFNs技术，可以在12个月内得到双等位基因完全敲除并且不含有抗性基因的克隆牛。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用锌指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用锌指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法，包括如下步骤：