[发明专利]硫酸类肝素二糖的制备纯化方法及其纯化产品

说明书

技术领域

本发明属于天然产物制备纯化领域，更具体涉及一种硫酸类肝素二糖的制备和纯化方法及其纯化产品。

背景技术

硫酸类肝素是由三种不同硫酸化程度的区域交替组成的：N-乙酰化区域（NA）是由完全无硫酸化的 GlcNAc-GlcUA二糖单元组成；N-硫酸化区域（NS）是由高度硫酸化的GlcNS(±6S)-IdoUA(2S)二糖组成，每个二糖有2-3个硫酸基；而N-乙酰化/N-硫酸化区域（NA/NS）是个过渡区域，同时含有无硫和含硫的二糖并且交叉的排列，其序列大致为GlcNAc-GlcUA-GlcNS-IdoA。硫酸类肝素中存在的12种代表性的二糖结构如图1所示，其中含GlcNAc、GlcNSO₃残基的二糖为主要存在形式，而带正电荷的GlcNH₃⁺残基二糖的含量微少。

至今为止关于肝素化学修饰的主要文献有 Inoue Y等，使用5％水(或甲醇)/二甲亚砜溶液可选择性地脱除肝素吡啶盐中N位上的硫酸基团；jaseja M等，通过pH=12．5—12．8的Na0H水溶液，a-L-艾杜糖醛酸片段上2S可以定量地脱除；Ayotte L等，使用9：1的Me₂SO-水，Hanno B 等使用N-甲基吡咯烷酮水溶液可脱去6S。以上都是基于对长链肝素的修饰。

现有的商品化的硫酸类肝素二糖都是由肝素及其衍生物制备得到的。首先通过对完整肝素链的修饰，然后经过肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，它们能特异性地裂解肝素链上具有特殊修饰的结构，从而产生不同的寡糖片段。但是这种方法不能制备大量的特定所需的二糖结构，且制备的步骤繁多，价格比较昂贵。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种硫酸类肝素二糖的纯化方法，通过肝素二糖Hex(2S)-NS(6S) 来制备硫酸类肝素中的游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖，将促进硫酸类肝素中特殊结构的研究。

本发明是通过如下技术方案实施的：

一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法是以肝素二糖为原料，经过阳离子交换树脂洗脱，吡啶调节洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶二糖；所述的肝素吡啶二糖分别与1-甲基-2-吡咯烷酮的水溶液，乙酸酐，Na₂CO₃和硫磺三氧三甲胺联合体反应，反应液经凝胶树脂分离，纯化得到游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。

所述的肝素吡啶二糖的制备方法包括：

1）在2-5℃中，将肝素二糖水溶液通过阳离子交换树脂，之后再用1-3倍树脂体积的蒸馏水洗脱；

2）在室温中，用吡啶将所得的洗脱液在搅拌的状态下，中和至PH为6～6.5；

3）将中和后的溶液放至在-70℃下冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述的肝素吡啶二糖。

所述的游离氨基二糖是通过如下的制备纯化方法：

1）将肝素吡啶二糖溶于1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液中，在水浴中反应8-12h，水浴温度为60-70℃，所述的1-甲基-2-吡咯烷酮与水的体积比为：8-9:1-2；

2）将反应后的溶液冷却，加入NaOH溶液，置于－4℃的条件下过夜；

3）将过夜后的反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；

4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为游离氨基二糖。

所述的肝素吡啶二糖的加入量为1-4mg,所述的1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液的体积为1-3mL；所述步骤2）NaOH溶液的浓度为0.05-0.02mol/L，加入体积为10-30μL。

所述的N-乙酰二糖是通过如下方法制备纯化：

1）将游离氨基二糖加入到PH为7-8的NaH₂PO₄ -Na₂HPO₄缓冲体系中，在4℃时恒温反应0.5-1小时；

2）在搅拌下逐渐加入相当于样品两倍摩尔量的乙酸酐，反应10-20分钟；

3）将反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min；

4）将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-乙酰二糖。