[发明专利]一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的方法。

背景技术

炭疽杆菌是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高。炭疽杆菌含有两个致病相关的毒力大质粒：pXO1(181.6kb)和pXO2(96.2kb)。质粒pXO1编码保护性抗原、致死因子和水肿因子等炭疽毒素蛋白及他们的调控基因。质粒pXO2编码参与荚膜形成和降解的基因。这两个质粒对于炭疽杆菌的致病性至关重要，丢失任何一个质粒都会导致炭疽菌的毒力极大的减低。因此对于炭疽杆菌毒力大质粒的研究一直是研究的热点。构建驱除毒力质粒的突变菌株对于研究质粒在炭疽杆菌致病中的作用及染色体的相关调控非常重要。

驱除细菌的大质粒可以使用驱除化学试剂，比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高温培养或紫外照射等方法。但是这些方法都有潜在的问题，第一是特异性差，即在驱除目的质粒的过程中可能驱除目的质粒以外的其他质粒，第二是可能在处理过程中宿主细胞产生随机突变的可能性。

质粒不相容是两个不同的但是相关的质粒不能稳定地在同一个细胞中遗传。这些质粒被放在一个相同的不相容群。这种不相容性主要是由于互相竞争相同的复制位点或分离位点，或者是由于复制起始的抑制。使用这个原理可以模拟自然机制使用一个小的、高拷贝的质粒来去除毒力大质粒。这种方法驱除质粒可以特异的构建质粒缺失菌株而避免了诱导突变的危险。在一些细菌中已经应用质粒不相容原理成功的驱除了目的质粒，证明这是一种高效、安全的方法。但是由于对炭疽杆菌大质粒pXO1的复制相关序列还不是很清楚，因而该方法还未用来驱除炭疽杆菌的大质粒pXO1。

早在1881年，Pasteur首先采用高温培养减毒方法，获得两株具有荚膜的弱毒菌株(pXO1^-pXO2⁺)，用以制备巴氏I苗和II苗。主要用于欧洲和其它国家的畜群免疫；2006年展德文等采用42℃高温培养法，驱除了炭疽杆菌人用减毒疫苗株A16R(pXO1⁺pXO2^-)中的大质粒pXO1，获得一株无质粒的炭疽菌A16RP(pXO1^-pXO2^-)；2007年韩国的Sung-Ha Park等人，采用42℃高温培养法从炭疽杆菌H9401(pXO1⁺pXO2⁺)株中驱除了大质粒pXO1，获得了一株衍生菌H9401(pXO1^-pXO2⁺)。这些驱除pXO1的方法中，pXO1的丢失是随机的，必须经过大量的筛选过程，有时甚至得不到所需要的菌株，另外，在筛选的过程中可能导致宿主菌染色体的随机突变。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将DNA分子插入穿梭质粒的SmaI位点得到的载体；

所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1。

所述穿梭质粒为温敏型穿梭质粒，

所述温敏型穿梭质粒具体为pKSV7。

所述重组载体在驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将所述的重组载体转入出发菌，得到重组菌；将所述重组菌传代培养，至所述重组菌中的炭疽杆菌毒力大质粒pXO1被驱除，得到驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的重组菌。

所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1方法中，在将所述的重组载体转入出发菌前，还包括将所述重组载体去甲基化的步骤，

所述去甲基化的方法包括如下步骤：

1)、将所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌1；

2)、提取步骤1)得到的所述重组菌1的质粒，得到去甲基化的重组载体；

所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1方法中，还包括将所述驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的重组菌去除所述重组载体的步骤，

所述将驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1的重组菌去除所述重组载体的方法包括如下步骤：