[发明专利]丹参内生真菌及其应用

权利要求书

1.一种丹参内生真菌，其特征在于，它的命名为深绿木霉Trichoderma atroviride，其保藏登记号为CGMCC No.4712。

2.根据权利要求1所述的丹参内生真菌，其特征在于，它的显微形态为：培养的菌丝体无色、分枝繁复，由具有横隔的分枝菌丝构成，分枝角度为近似90°；分生孢子梗的可育延伸物没有或者很少产生，没有不育的菌毛；虽然成对着生的分枝比较常见，但是分生孢子梗的典型分枝方式为单侧分枝；分生孢子绿色，亚球形至卵圆形，没有明显的脱落痕迹，光滑，成簇着生于分生孢子梗的顶端。

3.根据权利要求1所述的丹参内生真菌，其特征在于，它的固体培养为PDA培养基上26℃培养，生长迅速，菌落在3天内覆盖直径80mm的平板，呈辐射状，表面疏松、平坦，菌丝无色；在培养的第5天明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹；有椰子气味。

4.根据权利要求1所述的丹参内生真菌，其特征在于，它的液体培养为

(1)培养基PDA，摇瓶培养10天，培养温度26±1℃；

(2)发酵培养特征：

培养第1-2天有少许1-2mm白色菌丝球出现，培养液澄清；培养第3-4天，菌丝球直径增大至3-4mm，培养液开始变浑浊；培养第5-8天，菌球数量增多，培养液浑浊；培养第9-10天，白色菌球体直径为4-5mm，培养液又变澄清。

5.根据权利要求1所述的丹参内生真菌，其特征在于，它的ITS和5.8S rDNA碱基序列如SEQ ID NO.1所示为：

CCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCG

GGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCA

ACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAA

ATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGA

ACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT

TGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTC

AACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACG

GGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT

TTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCT

GAAATG。

6.如权利要求1-5中任何一项所述的丹参内生真菌在制备丹参酮类化合物丹参酮I和丹参酮II A中的应用。

7.根据根据要求6所述的应用，其特征在于，丹参内生真菌制备丹参酮类化合物丹参酮I和丹参酮II A包括下列步骤：

(1)取丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于26±1℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体培PDA种子培养基中，26±1℃下180rpm摇床培养72小时，得种子；

(3)配制好的PDA液体培养基，分装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接种入种子，26±1℃下180rpm摇床培养10天；

(4)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，超声处理45min；而后过滤减压蒸干，甲醇复溶残留物既得丹参酮类化合物丹参酮I和丹参酮II A。