[发明专利]一种筛选中药单体的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及筛选中药单体的方法，具体涉及一种应用线粒体指标技术筛选中药单体的方法，尤其是筛选抗肝细胞氧化损伤的中药单体的方法

背景技术

研究揭示了肝细胞氧化损伤是肝纤维化等疾病的病理基础，在这一过程中细胞内的能量中心，线粒体功能发生改变，并由此介导细胞凋亡进程。已知线粒体是真核细胞的重要细胞器，不仅是动物细胞的能量中心，生成ATP的主要地点，而且在细胞凋亡中还承担着主开关的角色。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH，NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化磷酸化产生ATP。线粒体呼吸链主要由四种复合物构成，其中是复合物I和复合物III是细胞内活性氧(reactive oxygen species)主要来源。在细胞受到凋亡信号作用下，线粒体作为细胞凋亡的主开关角色，细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species)ROS的水平上升，线粒体发生膨胀，继线粒体内外膜之间非特异的通透转运孔道开放，造成线粒体膜通透性(mitochondria permeability transition Pore，MPTP)的增加，使线粒体膜电位(Mitochondrion membrane potential，MMP)降低并且同时伴随ATP水平的下降，由于线粒体外膜破裂，促使位于线粒体膜间隙的细胞色素C(Cytochrome C)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)、Ca2+以及膜间隙中的其他商户因子被释放至细胞质，它们将形成凋亡复合体激活凋亡蛋白家庭的主要成员天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)，最初被激活的是起始者Caspase9分子，最终激活执行者Caspase3而诱导细胞凋亡。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)主要来源于线粒体，是在呼吸链氧化磷酸化过程中产生ATP，产生的氧代谢副产物ROS。呼吸链产生的低水平ROS对细胞的生命活动是必须的，比如线粒体到细胞核的信号传导。当细胞受到某种刺激，细胞内活性氧水平会升高，导致线粒体膜的渗透性改变且释放细胞色素c而引起细胞凋亡，因此可以通过活性氧检测技术检测细胞氧化损伤的情况。DCFH-DA是目前最常用、最灵敏的细胞内活生氧检测探针。DCFH-DA能进穿过细胞膜进入细胞，被酯酶水解成DCFH，DCFH本身没有荧光，如果细胞内活性氧水平高，与能DCFH反应生成有荧光的DCF。线粒体活性氧技术能很有效检测出药物对肝细胞凋亡的保护作用。

线粒体膜电位(mitochondria membrane potential)正常是线粒体形使功能基本保障，当细胞受到凋亡信号刺激后，细胞内活性氧水平升高，导致线粒体膜结构改变，线粒体膨胀，线粒体膜通透孔开放导致膜间隙内细胞色素C，凋亡诱导因子等释放到细胞质诱导细胞凋亡。因而可以通过线粒体膜电位检测技术来判断细胞是否处于早期凋亡阶段。一般用罗丹明(Rhodamine 123)、Di₃O₆、JC-1等阳离子荧光染料检测。线粒体膜电位检测技术能检测细胞是否处于细胞凋亡早期阶段。

ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变，会影响许多细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降，而高葡萄糖刺激等对于一些细胞可以上调细胞内ATP水平。通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降，在细胞凋亡时ATP水平的下降通常和线粒体的膜电位下降同时发生。线粒体ATP检测技术能反应线粒体功能是否受损。

细胞色素C存在于线粒体膜间隙，是电子传递链必不可少的组成成分。细胞色素C作为凋亡起始因子，也是线粒体凋亡途径中必不可少的分子。当细胞接受凋亡信号刺激，线粒体膜通透发性改变，细胞色素C从线粒体膜内隙释放到细胞中，与另一个凋亡因子Apaf-1结合，激活Caspase家族，诱导细胞凋亡。