[发明专利]检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的Bowman-Birk类型的双头蛋白酶抑制剂，即一个抑制剂分子可以抑剂两个胰蛋白酶分子的催化活性。自上世纪80年代，CpTI基因作为一种抗虫基因成为转基因植物的备选基因，并在表达后与非转基因植物相比表现出优良的抗虫特性，目前已成为我国众多转基因棉花品种中所携带的基因。准确评价CpTI转基因作物的生态和食品安全性、进行转基因产品的强制标识，检验和监测转基因作物种子的纯度等，必须建立起一套具有自主知识产权的快速、准确的外源基因表达蛋白的检测方法。目前检验CpTI转基因植物常用的方法是基因层面的分子检测方法。由于酶联免疫测定技术具有高通量、快速及灵敏度高等特点，在转基因植物鉴定等方面已经获得了广泛的应用，但CpTI的双抗夹心酶免疫检测方法还未见报道，所以建立一种精确的CpTI免疫检测方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体。

本发明所提供的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6分泌产生的。

本发明的另一个目的是提供保藏编号为CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6。

所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体在制备检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一个目的是提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒，含有所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂的多克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品；所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品为豇豆胰蛋白酶抑制剂。

所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品的浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL和0.39ng/mL。

所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品按照包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将豇豆种子粉浸泡于质量百分比为0.3％的氯化钠水溶液中，得到浸泡后的混合物；将所述浸泡后的混合物离心，取上清液，即得到提取液；将所述提取液用饱和硫酸铵溶液进行盐析粗纯化，取30％-60％盐溶度间的蛋白溶液，即得到粗纯化的豇豆胰蛋白酶抑制剂溶液；所述浸泡的温度为4℃和浸泡时间为16h；所述粗纯化的温度为4℃和粗纯化时间为4h；

(2)将步骤(1)得到的粗纯化的豇豆胰蛋白酶抑制剂溶液在以下条件下进行凝胶过滤：葡聚糖G-50填料，16mmx100cm层析柱，0.1M pH7.0PBS缓冲液洗脱，流速0.3ml/h，1.5mL/管进行分步收集，取活性高部分浓缩，得到浓缩液；

(3)将步骤(2)得到的浓缩液在以下条件下进行亲和层析：CNBr-Sepherose4B填料，以猪胰蛋白酶作为配基，上样缓冲液为0.1M pH7.0PBS缓冲液，洗脱液为0.1MpH3.0甘氨酸-HCL缓冲液，流速1mL/min，每1mL进行分步收集，取浓度高收集液合并，0.1M PH7.0PBS缓冲液透析冻干，用体积比为1∶1的水∶甘油混合液进行溶解，即豇豆胰蛋白酶抑制剂。

所述试剂盒中含有用于标记所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的标记酶。

所述试剂盒中包括包被缓冲液、洗涤液、底物缓冲液、终止缓冲液和封闭液；

所述包被缓冲液由Na₂CO₃、NaHCO₃和水组成；

以上各成分在包被缓冲液中的浓度分别为：Na₂CO₃0.01M和NaHCO₃0.04M；

所述洗涤液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、吐温-20和水组成；

以上各成分在洗涤液中的浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和吐温-20的体积百分比浓度为0.1％；