[发明专利]一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗，其特征在于，目标疫苗蛋白为呼肠孤病毒外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7。

2.如权利要求1所述的口服基因工程疫苗，其特征在于，所述的外壳蛋白vp5基因的扩增引物对为：

上游引物：TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT

和下游引物：ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA；

外壳蛋白vp7基因的扩增引物对为：

上游引物：CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC

和下游引物：ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC。

3.一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)首先用RT-PCR的方法从呼肠孤病毒株感染的CIK细胞中，扩增出呼肠孤病毒株RNA基因组相应的cDNA；再以所得的cDNA为模板，用PCR的方法扩增出外壳蛋白vp5基因和外壳蛋白vp7基因的全序列；其中外壳蛋白vp5基因的扩增引物对为：TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT和ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA；蛋白vp7基因的扩增引物对为CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC和ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC；

(2)构建表达外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7的原核表达质粒：外壳蛋白vp5基因片段用Sma I和Not I双酶切后分别克隆到原核表达载体pGEX4T-3的相应位点中；外壳蛋白vp7基因片段用BamH I和Sal I双酶切后分别克隆到原核表达载体pGEX4T-3的相应位点中；

(3)将上一步所得的阳性重组质粒pGEX-vp5和阳性重组质粒pGEX-vp7分别转化至表达菌株DH5α中，得阳性表达菌株；

(4)基于外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7的口服疫苗的制备：将(3)所得的阳性表达菌株DH5α灭活后，与鱼颗粒饲料混匀，再加入鱼肝油拌匀。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，其中：

所述的阳性表达菌株DH5α灭活方法为：将步骤(3)所得的阳性表达菌株DH5α离心富集后首先用0.5％甲醛在20℃灭活，用1X PBS缓冲液洗涤除掉甲醛，最后用1X PBS缓冲液重悬至使用浓度10⁹个/ml；

所述的鱼颗粒饲料为0.005-0.05g/颗；

所述的混匀为：将鱼颗粒饲料与阳性表达菌株DH5α菌悬液在冰上混合10-20分钟，阳性表达菌株DH5α用量为每克饲料2-10ml；

所述的鱼肝油的加入量为能防止入水后灭活的阳性表达菌株DH5α向水中扩散的量。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的鱼颗粒饲料为0.02g/颗。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的混匀的混合时间为15分钟，阳性表达菌株DH5α用量为每克饲料5ml。