[发明专利]一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程疫苗领域，尤其涉及一种用于治疗呼肠孤病毒引起的草鱼出血病的口服基因工程疫苗，及其制备方法。

背景技术

草鱼具有生长快、个体大、产量高、饲料要求低特点，是当前较理想的节粮型池塘养殖品种，尤其在鱼饲料价格上升，池塘养殖成本增长的形势下，增加草鱼养殖比例，可增加池塘经济效益，具有现实意义。草鱼出血病是严重危害当年草鱼鱼种的一种传染性疾病。这是一种流行广，季节长，发病率高，死亡率极高的一种疾病。草鱼出血病是影响我国草鱼养殖业可持续性发展的最主要病害之一。

我国目前没有治疗草鱼出血病的有效药物，对该病主要靠免疫预防。市场上销售的疫苗产品主要包括草鱼呼肠孤病毒(Reovirus)的组织浆灭活苗和体外细胞培养的减毒苗。由于这两种疫苗的生产成本高，只适合用注射的方式免疫草鱼，不利于其大规模推广应用。用基因工程的方法利用微生物发酵技术研制的口服化疫苗显然会更加符合水生动物的特点，也有利于该疫苗的大规模推广应用。

发明内容

为了克服现有疫苗生产成本高，只适合用注射方式进行免疫的问题，本发明公开了一种用基因工程的方法，利用微生物发酵技术研制的口服化疫苗，及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案如下：

提供一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗，目标疫苗蛋白为呼肠孤病毒外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7。

所述的外壳蛋白vp5基因的扩增引物对为：

上游引物：TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT

和下游引物：ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA；

外壳蛋白vp7基因的扩增引物对为：

上游引物：CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC

和下游引物：ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC。

本发明还提供一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)首先用RT-PCR的方法从呼肠孤病毒株感染的CIK细胞中，扩增出呼肠孤病毒株RNA基因组相应的cDNA；再以所得的cDNA为模板，用PCR的方法扩增出外壳蛋白vp5基因和外壳蛋白vp7基因的全序列；其中外壳蛋白vp5基因的扩增引物对为：TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT和ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA；蛋白vp7基因的扩增引物对为CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC和ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC；

(2)构建表达外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7的原核表达质粒：外壳蛋白vp5基因片段用Sma I和Not I双酶切后分别克隆到原核表达载体pGEX4T-3的相应位点中；外壳蛋白vp7基因片段用BamH I和Sal I双酶切后分别克隆到原核表达载体pGEX4T-3的相应位点中；

(3)将上一步所得的阳性重组质粒pGEX-vp5和阳性重组质粒pGEX-vp7分别转化至表达菌株DH5α中，得阳性表达菌株；

(4)基于外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7的口服疫苗的制备：将(3)所得的阳性表达菌株DH5α灭活后，与鱼颗粒饲料混匀，再加入鱼肝油拌匀。

其中，在步骤(4)中：

所述的阳性表达菌株DH5α灭活方法为：将步骤(3)所得的阳性表达菌株DH5α离心富集后首先用0.5％甲醛在20℃灭活，用1X PBS缓冲液洗涤除掉甲醛，最后用1X PBS缓冲液重悬至使用浓度10⁹个/ml；

所述的鱼颗粒饲料为0.005-0.05g/颗，优选为0.02g/颗；

所述的混匀为：将鱼颗粒饲料与阳性表达菌株DH5α菌悬液在冰上混合10-20分钟，优选为15分钟；阳性表达菌株DH5α用量为每克饲料2-10ml，优选为5ml；

所述的鱼肝油的加入量为能防止入水后灭活的阳性表达菌株DH5α向水中扩散的量。

呼肠孤病毒是鱼类出血病的致病因子。呼肠孤病毒的基因组由11条双链RNA构成，并被两层蛋白质外壳包裹。最外层蛋白衣壳由vp5和vp7形成的二聚体构成，这两个蛋白质主要参与病毒对宿主细胞的识别与吸附。由于病毒外膜蛋白通常也是诱导宿主产生中和性抗体的蛋白质，所以本发明将vp5和vp7选定为目标疫苗蛋白，可以得到好的免疫效果。