[发明专利]鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗，其特征在于它是由含有鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌五种灭活细菌菌悬液和黄芪多糖佐剂原液混合而成。

2.根据权利要求1所述的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗，其特征在于所述的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗中五种灭活细菌的终浓度均为10⁸～10⁹cfu/mL，所述的黄芪多糖佐剂的终浓度为7.5～17.5mg/mL。

3.一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗的制备方法，它的步骤为：

(1)将能够感染鲆鲽类发病的鳗弧菌、大菱鲆弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、迟钝爱德华氏菌接种到胰蛋白胨大头肉汤培养基平板上，28℃培养24h-48h进行复苏；

(2)分别挑取上述5株病原菌到胰蛋白胨大头肉汤液体培养基中，28℃振荡培养24h，收集培养液在4℃条件下5000rpm离心5分钟，将离心后的沉积菌体用pH＝7.2的PBS缓冲液冲洗3遍后，用灭菌后的1.5％(重量比)的NaCl溶液分别制成10⁹～10¹⁰cfu/mL的菌悬液原液；

(3)将五种病原菌的菌悬液原液分别灭活后，1∶1∶1∶1∶1等体积混合，即为鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液；

(4)将上述步骤得到的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液与黄芪多糖佐剂原液按1∶1的体积比混合，振荡均匀得到含黄芪多糖的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗。

4.根据权利要求3所述的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的五种病原菌灭活方法分别为在哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌菌悬液原液中添加0.5％(v/v)的福尔马林溶液；在大菱鲆弧菌和鳗弧菌菌悬液原液中添加1.0％(v/v)的福尔马林溶液；在爱德华氏菌菌悬液原液中添加1.5％(v/v)的福尔马林溶液，28℃、110～120r/min的转速振荡灭活处理48h后，用PH＝7.2的PBS缓冲液洗脱3次去除福尔马林。

5.根据权利要求3所述的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的黄芪多糖佐剂原液，是将多糖含量≥78.2％黄芪多糖原粉用蒸馏水溶解，配制成黄芪多糖浓度为15～35mg/mL的溶液，经115℃高压灭菌10min后，自然冷却制备而成。