[发明专利]重组葡激酶二聚体的制备及聚乙二醇定点修饰

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质化学领域，涉及一种重组葡激酶二聚体的制备方法及其N-末端的聚乙二醇定点修饰，能够延长葡激酶在体内的循环半衰期和提高葡激酶的生物活性。

背景技术

葡激酶(SAK)是一种含136个氨基酸的单链蛋白，相对分子量为15.5kDa。作为新一代溶栓药物，其溶栓效力与第二代溶血栓药物组织纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogenactivator，t-PA)相当，但价格却远低于t-PA及其衍生物。目前，国内外重组葡激酶的研究都已进入III期临床试验阶段。葡激酶作为纤溶酶原(Plasminogen，Plg)的激活因子，能与Plg形成1∶1的复合物，在痕量纤溶酶作用下，纤溶酶原被激活为纤溶酶，发挥溶栓效应。葡激酶通常通过在大肠杆菌的细胞溶质中高效表达来获得。但是，由于葡激酶具有抗原性和免疫原性，并且它在体内的半衰期很短，导致葡激酶需要多次重复注射，并且可能引发病人的不适应反应。

对葡激酶进行聚乙二醇(PEG)化学修饰可以有效解决上述缺陷。PEG是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过化学反应与蛋白质和多肽等共价结合。PEG修饰可以延长蛋白质药物在血液中的循环半衰期，并且降低其免疫原性和抗原性，从而提高蛋白质药物的药效。另外，PEG修饰可以增强蛋白质药物抵抗蛋白酶水解的能力，增强蛋白质药物的水溶性并且降低肾脏对蛋白质的排泄作用。

Collen等将葡激酶的Ser-3定点突变为Cys-3，Cys能与PEG-马来酰亚胺(Mal-PEG)产生特异性反应，生成定点修饰的均一产物。葡激酶的Cys突变体SY161分别与分子量为5kDa，10kDa和20kDa的Mal-PEG反应。PEG修饰后的SY161保持了完整的比活性、纤维蛋白溶解能力以及人体血浆内的纤维蛋白选择性。仓鼠、兔子和AMI患者的PEG-SY161血浆清除量随着PEG分子量的增大而降低。注射PEG-SY161后，抗体量在3-4周以后才达到中等水平，这远远低于注射野生型葡激酶。因此，PEG修饰大大的降低了葡激酶的免疫原性和抗原性，并且延长了它的循环半衰期。

然而，PEG修饰同时也存在一些问题。例如，PEG修饰导致葡激酶的生物活性降低。由于PEG为链状的大分子，它在屏蔽抗原决定簇的同时，也会干扰葡激酶与其受体纤溶酶原的相互作用，导致葡激酶的活性降低。因此，需要尝试设计和开发新的PEG修饰方法来解决上述问题，使葡激酶具有更好的药用价值。蛋白质的二聚体化可以通过增强蛋白质与其受体间的亲和力，提高蛋白的生物活性。另外，二聚体化后蛋白质的分子量成倍增加，这可以提高它在体内的循环半衰期。为制备定点结合的蛋白二聚体，通常采用基因工程为辅助手段的化学聚合方法。因此，为了使葡激酶在血液的循环半衰期延长，抗原性和免疫原性降低，并且保持较高生物活性，本发明将蛋白质的二聚体化和PEG修饰两种方法有效地结合起来。

发明内容

为了降低葡激酶的抗原性和免疫原性、提高葡激酶在体内的循环半衰期和药效，并且降低用药次数，本发明公开了一种在C-末端引入半胱氨酸的重组葡激酶。

本发明还公开了该重组葡激酶的制备方法。

本发明还公开了用同型双功能连接剂，即两端含有相同官能团的试剂，来制备重组葡激酶二聚体的方法。

本发明还公开了该重组葡激酶二聚体实现N-末端聚乙二醇定点修饰的制备方法。

本发明的重组葡激酶突变体，与野生型葡激酶相比，在C-末端多了3个氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。由于引入的氨基酸远离葡激酶的活性中心，二聚体化对葡激酶的活性影响较小。

本发明所述重组葡激酶的制备方法包括如下步骤：

构建重组葡激酶突变基因、突变基因与质粒连接构建表达载体、载体转化入大肠杆菌并进行高效表达、重组葡激酶蛋白的分离纯化。本发明采用PCR法构建的葡激酶突变基因与pET15质粒结合，在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。表达产物主要集中于菌体细胞超声破碎离心后的上清液中。用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析法获得了纯化的重组葡激酶。

本发明所述重组葡激酶二聚体的制备采用以下方案：

所述的同型双功能连接剂为1，4-二马来酰亚胺丁烷(1，4-bismaleimidobutane，BMB)，其特征在于能与半胱氨酸的巯基产生特异性反应，生成硫醚键，并且在还原性条件下不会被破坏。所述的葡激酶二聚体化是通过1，4-二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与葡激酶C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。

葡激酶二聚体的制备条件如下：