[发明专利]一种转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法

权利要求书

1.一种利用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，ATCC948)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：利用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸。

2.如权利要求1所述的转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其详细操作步骤为：

(1)菌种选择：选用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)，采用以乳酸为唯一碳源的培养基进行培养，该菌株具有高乳酸氧化酶活力和过氧化氢酶活力；

 (2)斜面培养：将荧光假单胞菌菌株接种于含有1.5-2.0％的琼脂糖并加有1.0-2.0％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25-35℃培养20-30小时；

(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～100mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，25-35℃ 条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得一级种子；

(4)扩大培养：以3-5％(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得二级种子； 

(5)发酵罐培养：以3-5％(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0.1-0.5% 葡萄糖、1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，培养6-8小时补料，补料液为15-25%的乳酸钠溶液，补料速度为0.2-0.3 mL/min，培养10-15小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法（CE）方法检测丙酮酸生成量；

(6)收集菌体：取步骤(4)的发酵液6000-8000转/分离心10-15分钟，收集菌体沉淀，并用pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2～3次；再将菌体溶于pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100～200克湿细胞；

(7)超声波裂解细胞：超声波破碎菌体细胞5-10分钟(脉冲5秒，脉冲间隔5秒)，然后离心30-60 分钟（30,000-35,000转/分），取上清液即得荧光假单胞菌粗酶液，在4℃储存，备用；

(8)转化实验：将步骤(7)中的荧光假单胞菌粗酶液与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的终浓度达到5.54-1,080mM，加入终浓度为0-1.0 mM的乙二胺四乙酸钠（EDTA），粗酶液蛋白浓度达到70-300 mg/L，37-42℃，pH7.2条件下，150-200转/分钟振荡5-160小时；每间隔10分钟-15小时取样检测底物消耗量和产物生成量；

(9)样品盐析去除酶蛋白：取样样品中加入饱和度为50-60%的硫酸铵沉淀酶蛋白，6000-8000转/分离心10分钟，得到上清液即为样品；

(10)样品检测：待步骤(9)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用毛细管电泳法（CE）测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。

3.如权利要求1所述的转化DL -乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：液体基本培养基(LLM)组成为按重量计的下述组分：磷酸氢二钾 0.05%，氯化钠 0.05%，硫酸镁 0.05%，硫酸亚铁 0.001%，酵母膏0.1%，余量为水。