[发明专利]一种转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于丙酮酸的制备方法的技术领域，涉及一种利用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。

背景技术

丙酮酸（Pyruvate）是一种重要的医药、化工产品，它不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且可作为多种有用化合物的前体。传统的化学合成丙酮酸的方法是以酒石酸为原料，通过和硫酸氢钾高温下反应得到丙酮酸，这个反应过程中还需要引入氰化钠和乙酰卤化物合成乙酰氰化物，并进一步水解乙酰氰化物，这种工艺原料成本较高，产率也较低。

发酵法制取丙酮酸转化率也往往较低，这是因为丙酮酸在糖代谢中处于最活跃的中心节点，在细胞中很容易转化为其他化合物,因此很难累积，而且，丙酮酸作为发酵产物混合物的一种成分，往往是相当低浓度的，从复杂的发酵液中分离提取丙酮酸，一般是难以进行的，费用也较昂贵。

酶法生产丙酮酸是近期研究多采用的技术，乳酸脱氢酶能使乳酸（Lactate）一步生成丙酮酸，该酶催化反应如下：

Lactate + NAD+ ←→Pyruvate + NADH + H⁺

该反应是可逆反应，反应平衡倾向于乳酸一边；辅酶NAD+为小分子化合物，很难固定，不易再生，而且价格昂贵，这些因素限制了乳酸脱氢酶的应用。

乳酸氧化酶作为一种黄素蛋白，是以FMN或FAD作为辅因子，其电子转移的形式不同于经典的电子传递链，而是直接以氧作底物, FMN或FAD和酶蛋白结合非常牢固,整个反应过程不需要游离的外源辅酶参与,这就解决了辅酶再生的问题。细菌细胞内乳酸氧化酶催化的生化反应式为：

CH₃CH₂OHCOOH（乳酸） + O₂CH₃COCOOH（丙酮酸） + H₂O₂

该反应生成的过氧化氢继续与丙酮酸进行无酶催化反应生成乙酸和二氧化碳。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种利用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。

本发明采用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，利用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸。

本发明的转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其详细步骤为：

(1)菌种选择：选用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌(Psendomonasfluorescens)，采用以乳酸为唯一碳源的培养基进行培养，该菌株具有高乳酸氧化酶活力和过氧化氢酶活力；

(2)斜面培养：将荧光假单胞菌菌株接种于含有1.5-2.0％的琼脂糖并加有1.0-2.0％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25-35℃培养20-30小时；

(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～100mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，25-35℃ 条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得一级种子；

(4)扩大培养：以3-5％(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得二级种子；

(5)发酵罐培养：以3-5％(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0.1-0.5% 葡萄糖、1.0-2.0％DL-乳酸钠的LLM中，25-35℃条件下，培养6-8小时补料，补料液为15-25%的乳酸钠溶液，补料速度为0.2-0.3 mL/min，培养10-15小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法（CE）方法检测丙酮酸生成量；

(6)收集菌体：取步骤(4)的发酵液6000-8000??g离心10-15分钟，收集菌体沉淀，并用pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2～3次；再将菌体溶于pH7.4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100～200克湿细胞；