[发明专利]利用宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法

权利要求书

1.利用宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：

将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；

培养5～7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75～85％汇合度时，即采用胰酶消化传代；

2)、体外诱导分化：

将上述步骤1)所得的第4～6代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度为13～17％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；

在上述PBS清洗后的细胞中加入诱导培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；每1×10⁵个的细胞中加入0.8～1.2ml诱导培养基，所述诱导培养基为：在无血清DMEM培养基中含有1～10μM的5-氮胞苷；培养时间为68～76小时，得功能心肌细胞。

2.根据权利要求1所述的利用宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法，其特征是所述步骤1)依次为：

①、经血收集：

在采集管内设置20ml的Hank′s平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素60～100μg/mL、头孢氨苄150～350μg/mL、卡那霉素50～150μg/mL、庆大霉素80～160μg/mL、两性霉素B 2～3μg/mL及300～500单位肝素钠；以此作为含抗生素的杀菌液；

将15～20ml的经血放入上述采集管内，于0～4℃的低温下保存24～48小时；然后离心，去上清液；

②、原代培养：

A)、取6～10ml的Chang氏通用培养基加入到步骤①所得物中；

B)、将步骤A)的所得物放入培养瓶中置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱内培养；培养5～7天后全量换液；再将上述培养瓶直立3～8分钟，从而使未贴壁的细胞滑落至培养瓶底部，用移液管去除培养瓶中的培养基；

C)、在步骤B)所得的培养瓶中加入2～4mL的Chang氏通用培养基进行润洗，然后用移液管去除培养瓶中的培养基；

D)、在步骤C)所得的培养瓶中加入6～10mL的Chang氏通用培养基，置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱内培养；

所述Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mLMEM-alpha培养基、160～200mL的Chang B基液、10～30mL的Chang C基液、5～15mL青霉素/链霉素双抗(10,000U/mL苄青霉素钠，10,000μg/mL链霉素)，5～15mL的浓度为200mM的L-谷氨酰胺、130～170mL的胎牛血清；充分混匀，高压蒸汽灭菌后放入0～4℃冰箱保存待用；

③、细胞传代培养：

一旦步骤②原代培养的细胞生长至75～85％汇合度时，即采用胰酶消化传代；具体如下：

A)、一旦步骤②原代培养的细胞生长至75～85％汇合度时，去除培养液，然后用无钙镁离子的PBS洗涤液进行洗涤；

B)、加入2～4ml胰酶，置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中孵育4～6分钟；

C)、加入4～6ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；

D)、轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；

E)、按1∶8的比率传代；

F)、在每1ml的细胞悬液中加入5～7ml的Chang氏通用培养基；然后置于4～6％CO2、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养。