[发明专利]利用宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法。

背景技术

目前充血性心力衰竭发病率逐年升高，全球有1500万患者，每年新发病例为46.5万，为65岁以上人群首要住院原因，也是心血管死亡的最主要原因。以干细胞为种子资源的细胞移植疗法可促进梗死局部血管新生和心肌再生，进而改善心肌梗死后心功能，已成为目前心血管领域的研究热点。然而可供移植的胚胎心肌细胞增殖能力有限、取材不便，骨骼肌成肌细胞又不能与心肌细胞形成缝隙连接且会致心律失常，致使该治疗手段止步不前。因此以干细胞为种子资源的细胞治疗成为损伤组织修复和替代的重要手段。其中，人胚胎干细胞受到其自身一些因素的限制，如致瘤性、免疫原性和伦理问题等，尚不能作为理想的移植细胞源。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是具多分化方向能力的成体干细胞，因其进行自体移植无排异及来源的限制，是理想的移植细胞源。其中，骨髓间充质干细胞是目前主要的干细胞来源。尽管其伦理问题与胚胎干细胞相比大为减少，但骨髓细胞必须通过侵入的途径获得，而且随着年龄的增长，干细胞数量显著减少。因采集方式及自身含量的限制，骨髓间充质干细胞在临床应用上面临着难以突破的瓶颈。骨髓来源的间充质干细胞主要存在以下问题：

1.分化为心肌细胞、神经元细胞等功能细胞的潜能不够；

2.移植后大部分细胞死亡；

3.移植疗效不理想；

4.细胞数量限制。

子宫内膜细胞系具有很强的自我更新能力。在每个月经周期都会有组织和血管的大量增长，这一增长过程会随着月经周期的结束而停止。美日中等多国科学家的最新研究显示在随女性经血脱落的子宫内膜组织中，具有相当数量的间充质干细胞(基质干细胞)-宫内膜干细胞，数量为骨髓来源的30倍；这些干细胞活力更强，更强的自我更新和增殖能力，分化潜能更接近胚胎干细胞。有研究发现宫内膜干细胞不仅具有几乎每24小时复制一次的惊人速率，而且它们产生独特生长因子的速率，比来自于脐带血的干细胞要大上10万倍。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法，所得的功能心肌细胞能用于治疗心肌梗死。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用子宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法，包括以下步骤：

1)、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：

将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；

培养5～7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75～85％汇合度时，即采用胰酶消化传代；

一般，可每隔2～4换液一次，每3～4天传代细胞一次；

2)、体外诱导分化：

将上述步骤1)所得的第4～6代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度为13～17％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；

在上述PBS清洗后的细胞中加入诱导培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；每1×10⁵个的细胞中加入0.8～1.2ml诱导培养基，所述诱导培养基为：在无血清DMEM培养基中含有1～10μM的5-氮胞苷；培养时间为68～76小时，得功能性心肌细胞。

作为本发明的利用子宫内膜干细胞诱导分化功能心肌细胞的方法的改进：步骤1)依次为：

①、经血收集：

在采集管内设置20ml的Hank′s平衡盐溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素(Vancomycin)60～100μg/mL、头孢氨苄(Claforan)150～350μg/mL、卡那霉素(Amikacin)50～150μg/mL、庆大霉素(Gentamycin)80～160μg/mL、两性霉素B(Amphotericin B)2～3μg/mL及300～500单位肝素钠；以此作为含抗生素的杀菌液；将15～20ml的经血放入上述采集管内，于0～4℃的低温下保存24～48小时；然后离心，去上清液；

②、原代培养：

A)、取6～10ml的Chang氏通用培养基加入到步骤①所得物中；