[发明专利]小麦TaTOC1基因及其克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及小麦TaTOC1基因及其克隆方法与应用，属于农作物转基因技术领域。

背景技术

植物由营养生长阶段向生殖生长阶段的转变，即成花转变，是植物完成整个生活周期的关键步骤。植物开花时间受内在发育信号和外部的环境信号共同控制。近些年来的研究表明，主要有四条途径控制开花，分别为光周期促进途径、自主促进途径、春化促进途径和GA促进途径。光周期现象是生物钟调控的诸多过程的一个特例，它是由生物钟和光信号共同作用的结果。光周期的感应器可以使植物准确地感知日照长度的变化，从而选择性地在合适的季节开花。过量表达LHY/CCA1和TOC1三个基因中的任一个都会导致转基因植株的昼夜节律性的破坏(Schaffer et al.，1998；Wang and Tobin，1998)，这说明它们是植物中心振荡器的核心元件。TOC1基因属于拟南芥PRR基因家族，它编码的蛋白含有非典型的接收域(pseudo-receiver domain)和CCT(CO，COL，and TOC1)结构域(Makino et al.，2000)，采用模式化和聚类分析的方法证明了这两个结构域可能分别发挥响应信号和转录调控的功能(Kolmos et al.，2008)。TOC1基因的mRNA和蛋白水平呈现昼夜节律性的积累，这种情况即使是在持续光照或持续黑暗的条件下依然表现的很明显(Strayer et al.，2000；Más et al.，2003b)。但最近的研究发现，TOC1在持续光照条件下的昼夜节律性表达的现象在拟南芥的根里并没有被检测到，而在茎中却有很明显的节律性的TOC1mRNA量的积累，这说明TOC1在不同器官中的作用模式很可能不同，这也用分子的证据说明植物不同器官的生物钟是具有特异性的，但并不排除不同器官的生物钟之间的相互联系与调控(James et al.，2008)。

拟南芥TOC1的第562位丙氨酸突变成缬氨酸后产生了toc1-1，它是一种弱的功能缺失型突变体，toc1-1的生物钟的昼夜节律周期相对于野生型拟南芥变短(Somers et al.，1998；Strayer et al.，2000)。而拟南芥中增加TOC1的表达时，植株的生物钟周期变长；当TOC1被过量表达时，转基因拟南芥的生物钟则完全变得紊乱(Makino et al.，2002；Más et al.，2003a)。这些都说明TOC1在维持生物钟正常节律方面的重要功能。因此，可以利用植物转基因技术来调节植物的生长发育周期。

长日照植物小麦是世界上重要的粮食作物之一。人们试图通过对育种和栽培方式的探索来改善其产量和品质。传统的主要育种手段之一是引种，即把外地或外国优良的作物品种引入当地，作为推广品种或是育种材料应用。但是小麦要完成从种子到种子的一个生长发育周期，必须通过春化阶段和光照阶段，否则就不能正常结实获取产量。但是由于全球各地的光照、温度等气候条件差异很大，所以引种工作受到很大的限制。如果能够利用生物技术手段调节小麦的生长发育周期，那么引种的范围就能够极大的扩大。

小麦是最重要的粮食作物之一，是人类食物和营养的基本来源。依赖于基因工程的进展可以解决目前我国小麦生产面临的干旱、病虫害以及遗传育种中优良品种引种范围窄等问题。由于小麦的遗传背景较其它作物复杂，遗传转化困难，因此是三个重要的禾本科作物中最后一个获得转基因成功的。尽管从1992年以来利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法、PEG法、电击法和激光微束法分别获得了转基因小麦，但其转化率未超过6％。由基因枪法等物理转化方法获得的转基因小麦存在外缘基因的拷贝数多、再生困难和不育等缺陷。小麦转化技术已成为限制小麦基因工程研究发展的重要因素。由于这种限制，至今已获得的有经济应用价值的转基因小麦极其有限。

在现有的小麦转化技术中，农杆菌介导的小麦遗传转化一直是国内外相关领域的热点和难点。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次报道了以小麦幼胚和胚性愈伤组织为外植体获得了农杆菌介导的转基因(npt II)再生植株，并提出了一套较为成熟的转化系统。1999年我国的夏光敏也报道了用农杆菌介导法将npt II基因导入小麦幼胚和胚性愈伤组织，得到转基因植株，转基因频率达到3.7-5.9％，明显高于其它小麦转化研究。但这些转化方法均需经过组织培养再生植株。已有的研究表明小麦不同基因型的受体材料对植株再生有显著影响。目前已知小麦幼胚和胚性愈伤组织的再生能力较高，但受基因型的限制很大，而我国多数生产用小麦当家品种，由愈伤组织分化再生非常困难，这限制了需经组织培养途径进行遗传转化技术的应用。