[发明专利]一种质粒载体pLGF及其应用

权利要求书

1.一种质粒载体pLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的质粒载体pLGF在选育香菇新品种中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)将经Nco I、BglII或Spe I内切酶中任意两个内切的目的基因插入经同样内切酶内切的上述质粒载体pLGF中，得到插入目的基因的质粒载体；

(2)将步骤(1)制得的插入目的基因的质粒载体转化根癌农杆菌EHA105，得到含目的基因的根癌农杆菌；

(3)将步骤(2)制得的含目的基因的根癌农杆菌侵染处理后的香菇菌球，得到侵染后的香菇菌球；

(4)将步骤(3)制得的侵染后的香菇菌球在含有10-20μg/mL潮霉素和300-500μg/mL头孢霉素的选择培养基中选择培养，得到表达目的基因的香菇新品种。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的转化，具体操作如下：

将根癌农杆菌EHA105在26-28℃200-250rpm的条件下，于含50μg/ml链霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₆₀为0.5-0.8，然后置于冰上15min，离心，弃上清液，再加入预冷的20mM CaCl₂溶液重悬，得重悬液；然后，向重悬液中加入含有插入目的基因的质粒载体，混匀，冰浴30min后，液氮速冻2min，37℃水浴5min，然后，加入等体积的LB液体培养基，26-28℃220rpm培养1hr，再经过含50μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的LB平板培养基筛选培养，得到含目的基因的根癌农杆菌。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的侵染，具体操作如下：

(a)将含目的基因的根癌农杆菌在26-28℃200-250rpm的条件下，于含50μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养22-25hr，再加入诱导培养基和乙酰丁香酮培养基，继续培养至OD₆₆₀ 0.2-0.5，得诱导后的农杆菌溶液；

(b)将处理后的香菇菌球浸入步骤(a)制得的诱导后的农杆菌溶液，浸染20-30min，浸染期间每隔5-10min振荡一次；然后将香菇菌球在诱导平板培养基中培养2-4天，培养温度22-25℃，得到侵染后的香菇菌球。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述处理后的香菇菌球制备方法如下：

取香菇菌体接种于PDA液体培养基中25℃，150-160rpm培养10天，离心，弃上清液，然后，用诱导培养基洗涤离心2-4次，得到处理后的香菇菌球。