[发明专利]一种质粒载体pLGF及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种质粒载体pLGF及其应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

香菇是一种重要的食药用栽培真菌，具有很高的营养、药用和保健价值，其中的香菇多糖具有免疫调节，抗肿瘤，抗感染等生物活性而受到广泛的关注(丛阳，黄敏.香菇多糖抗肿瘤的基础研究及临床应用进展。大连医科大学学报，2010，4(32)：465-470；迟彦，周东坡，平文祥，等.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用.菌物学报，2005，24(4)：612-619)，我国是世界香菇生产和贸易第一大国和人工栽培香菇的发源地。目前运用于香菇的遗传转化方法与动植物、微生物的转化方法基本相同，主要使用PEG法(Challen MP，Rao BG，Elliot TJ.Transformation strategies for A garicus bisporus.Wageningen：Pudoc，1991：129-134)，电激法(Chun-Yi Kuo，Ching-Tsan Huang.A reliable transformation method and heterologous expressionof β-glucuronidase in Lentinula edodes.Journal of Microbiological Methods，2008，(72)：111-115)以及限制性内切酶介导整合法(Sato T，Yaegashi K，Ishii S1998  Transformation of the ediblebasidiomycete lentinus edodes by restriction enzymemediated DNA integra

根癌农杆菌是革兰氏阴性菌，当其侵染双子叶植物受伤的部位时可以转移肿瘤诱导(Ti)质粒的部分T-DNA片段到植物基因组中产生冠婴瘤，属于天然遗传转化体系(迟彦，周东坡，平文祥，等.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用.菌物学报，2005，24(4)：612-619)。农杆菌转化真菌首先是在酵母中获得成功的，之后在1998年De Groot等人首次利用农杆菌成功的转化了丝状真菌后(de Groot MJA，Bundock P，Hooykaas PJJ，Beijersbergen AGM，1998，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.Nat Biotechnol 16：839-842.)，农杆菌被广泛的应用到真菌的转化中。在农杆菌介导真菌的转化过程中，乙酰丁香酮(AS)会诱导vir毒性基因的表达，编码的毒性蛋白会介导T-DNA的转移。VirDl和VirD2蛋白共同作用，识别T-DNA的末端重复序列，并在末端链上产生缺刻，而这些缺刻就成为T-DNA末端线性单链置换的起始位点和终止位点(M ichielse CB，Ram AF，Hooykaas PJ.Role of bacterial viru lence proteins in Agrobacterium.Mediated transform ation of Aspergillusawamori.Fungal GenetBiol.2004，41(5)：571-578)。T-DNA随即的插入到宿主基因组中，在整合过程中，宿主因素对同源或非同源整合起主要作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种质粒载体pLGF及其应用。该质粒载体可转化农杆菌后，通过农杆菌浸染香菇，从而将目的基因导入香菇菌体中获得稳定表达。通过本发明可以建立稳定有效的香菇外源基因转化体系，为获得稳定、遗传性状优良的转基因香菇新菌种提供了新的方法。

本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：

一种质粒载体pLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述质粒载体pLGF在选育香菇新品种中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)将经Nco I、BglII或Spe I内切酶中任意两个内切的目的基因插入经同样内切酶内切的上述质粒载体pLGF中，得到插入目的基因的质粒载体；

(2)将步骤(1)制得的插入目的基因的质粒载体转化根癌农杆菌EHA105，得到含目的基因的根癌农杆菌；

(3)将步骤(2)制得的含目的基因的根癌农杆菌侵染处理后的香菇菌球，得到侵染后的香菇菌球；