[发明专利]一种磁性复合微球固定化漆酶及其制备方法

权利要求书

1.一种磁性复合微球固定化漆酶，其特征在于，以表面螯合一种过渡金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺或Co²⁺)的磁性复合微球为载体，利用金属螯合配体与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用将漆酶固定在该载体上。

2.一种权利要求1所述磁性复合微球固定化漆酶的制备方法，该方法包括两个步骤：载体制备和漆酶固定。其中载体制备步骤包括：

(1)将溶有FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O混合物的十二烷基磺酸钠水溶液均匀混合，在搅拌条件下滴加2-5mol/L NaOH溶液至混合液pH为10-12，所得产物在80-100℃水浴中熟化30-60min后，在50-70℃下烘干，通过研磨得到四氧化三铁粉末；

(2)将四氧化三铁粉末超声分散于二次水中，搅拌下加入正硅酸乙酯和甲醇的混合溶液，持续搅拌15min后滴加浓氨水，继续搅拌反应4小时，50-70℃下烘干，得到核壳结构磁性二氧化硅粉末；

(3)将磁性二氧化硅粉末和γ-氯丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇和丙三醇混合溶液中，80℃下搅拌反应3小时后，50-70℃下烘干，得到硅烷化的磁性二氧化硅；

(4)将1.4g硅烷化的磁性二氧化硅与175mL 0.5-10mg/L的一种含羰基或氨基的聚合物溶液在50℃下搅拌反应3小时，50-70℃下烘干；取0.5g该烘干粉末与75mL 0.02-0.3mol/L含一种过渡金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺或Co²⁺)的硫酸盐溶液混合震荡，温度为25-30℃，震荡时间8-12小时，然后在50-70℃下烘干即得载体成品。

漆酶固定步骤包括：

将经载体制备步骤制得的载体成品与溶于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的游离漆酶5mL充分混合，在pH为2.5-6.0、温度为5-55℃条件下搅拌1-16小时，4℃条件下静置8-12小时后，用pH为3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液多次洗涤，直至洗涤液中没有蛋白检出，再经低温真空干燥制得固定化漆酶成品。

3.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于载体制备步骤(1)中所述的溶有FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O混合物的十二烷基磺酸钠水溶液的组成为0.25mol/L的FeCl₂·4H₂O、0.45-0.5mol/L的FeCl₃·6H₂O、0.2-0.5％质量分数的十二烷基磺酸钠。

4.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于载体制备步骤(2)中所述的甲醇、二次水和浓氨水的组成为80-120体积份的甲醇、40-60体积份的二次水、4-6体积份的浓氨水，四氧化三铁粉末的浓度为8.06g/L，正硅酸乙酯的浓度为16.12-32.24g/L。

5.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于载体制备步骤(3)中所述的磁性二氧化硅粉末的质量为1.5g，γ-氯丙基三甲氧基硅烷的体积为5-10mL，甲醇和丙三醇的体积分别为87.5mL和37.5mL。

6.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于载体制备步骤(4)中所述的一种含羰基或氨基的聚合物为聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺。

7.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于漆酶固定步骤中，溶于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的游离漆酶浓度为0.2-1.4g/L，游离漆酶和载体成品的混合比例为10-70mg/1g。