[发明专利]一种磁性复合微球固定化漆酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磁性复合微球固定化漆酶和该固定化漆酶的制备方法。更具体的说是制备一种可快速磁性分离，操作稳定性良好的磁性复合微球固定化漆酶。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在多种生物体内。漆酶可以催化空气中的氧气直接氧化分解各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚A、芳香胺等，在漆酶介体(ABTS、HBT等)存在下，漆酶还可以催化降解与木质素相关的二苯基甲烷、N-取代对苯基二胺、有机磷化合物(农药)及二噁英等。由于具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在造纸工业、废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、生物传感器构建及食品工业等方面具有重要的使用价值。但由于漆酶是由蛋白质组成，其高级结构对所处环境十分敏感，在使用过程中易受环境条件变化影响而导致变性失活，特别是游离酶与反应产物混合在一起，反应后不能回收，难以实现重复利用。而对酶进行固定后制成的固定化酶能克服上述缺点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还存在稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。

制备固定化酶的关键在于载体的选择，文献报导较多的可用于生物酶的固定化载体主要有表面富含功能基团的有机载体和机械稳定性较好的无机载体等。但这些载体材料普遍存在着合成价格昂贵，加工工艺复杂，分离效果差等缺点。近年来，随着磁性分离技术的日益发展，磁性粒子用于生物酶的固定化逐渐受到人们的广泛关注。然而磁性纳米粒子具有高比表面积、高比表面能，以及粒子各向异性的偶极矩作用从而很容易团聚，而且裸露的磁性材料耐酸碱性能差，在空气中容易氧化变质，从而导致不能形成稳定的分散体系，使其在磁性分离的应用中受到了限制。这就要求对于这些磁性材料进行改性，通常需要在外面包裹上保护层，以提高磁性材料的抗氧化能力，得到分散性较好的复合粒子。二氧化硅具有很好的生物相容性，良好的耐酸碱、耐有机溶剂及耐高温特性，对磁性纳米粒子的表面修饰可以降低其表面能，提高粒子的抗氧化能力，得到分散性好的纳米复合粒子，同时可用各种硅烷偶联剂在其表面引入各种官能基以用于酶等生物大分子的固定化。因此，二氧化硅包覆磁性粒子有无可比拟的优势。

近年来，固定化酶技术的研究得到了蓬勃的发展，目前用于固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、共价键结合法、包埋法等。其中，交联法和共价键结合法因反应条件较为剧烈，酶活力损失较大；包埋法由于底物结合部位和活性中心受载体封闭因而酶活损失较大；吸附法具有条件温和、酶活力部位及其空间构象不易被破坏的特点，但吸附法中由离子键、氢键、偶极键及疏水键固定的酶易受反应介质的pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。而采用金属螯合载体以配位作用固定化酶则能克服目前常用固定化方法中的一些不足。它利用金属螯合配体与蛋白质表面的供电子氨基酸-组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯醇基等以配位作用固定酶，酶与载体结合牢固不易脱落，同时避免了交联剂的使用对酶分子造成的化学损伤，更大程度上保持了酶分子的天然构象，可以更大限度保留酶活。

因此，在本发明中，通过在磁性二氧化硅表面螯合一种过渡金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺或Co²⁺)制得可固定漆酶的功能化磁性载体，以该载体通过配位作用固定化漆酶，该固定化漆酶不仅可以在外界磁场作用下实现快速分离，可回收反复使用，同时也增强了漆酶的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可快速磁性分离回收，操作稳定性良好的磁性复合微球固定化漆酶。本发明的又一目的在于提供上述固定化漆酶的制备方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种磁性复合微球固定化漆酶，以表面螯合一种过渡金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺或Co²⁺)的磁性复合微球为载体，利用金属螯合配体与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用将漆酶固定在该载体上。

一种磁性复合微球固定化漆酶的制备方法，该方法包括两个步骤：载体制备和漆酶固定。

载体制备步骤包括：

(1)将溶有FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O混合物的十二烷基磺酸钠水溶液均匀混合，在搅拌条件下滴加2-5mol/L NaOH溶液至混合液pH为10-12，所得产物在80-100℃水浴中熟化30-60min后，在50-70℃下烘干，通过研磨得到四氧化三铁粉末；