[发明专利]一种植物单拷贝基因的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物单拷贝基因的检测方法，属于分子细胞遗传学领域。

技术背景

荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)已广泛应用于细胞遗传学和基因组学研究，可以在间期核、染色体或DNA纤维等上定位特异的DNA序列，分析基因组的组成、结构、重排以及进化关系，尤其是随着基因组测序时代的到来，以荧光原位杂交为基础的物理图谱的绘制，将在基因组测序和图位克隆研究中起着重要的补充和辅助作用。在基因组中，除了包含大量的重复序列，还有一些单拷贝序列。在间期核、染色体或DNA纤维中，精确的检测和定位单拷贝序列依赖于杂交的特异性和检测的灵敏度。然而，与人类基因组FISH技术相比，在植物基因组研究中，FISH技术的灵敏度和分辨率受到了一定的限制。首先，由于植物细胞壁的存在，细胞壁和细胞质的碎片减少了探针与目标片段结合的机会，增加了背景，导致了较低的信噪比。其次，植物的中期染色体高度浓缩，也减少了探针与目标片段结合的机会，同时也降低了杂交的分辨率。

量子点（quantum dots，QDs），又名半导体纳米晶体，是一种新型的荧光标记试剂，在生命科学研究中得到广泛的应用。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有许多优势：(1)激发光波长范围宽而发射光波长范围窄，重叠小；(2)量子点的荧光强度高，抗光漂，灵敏度高；(3)可以通过改变量子点的大小和组成，获得不同颜色的量子点，适用于多色标记；(4)可以与许多生物大分子进行偶联,稳定性好，生物相容性好。通过检索现有技术，目前将量子点应用于荧光原位杂交中，主要有两种方法：一种方法是使用生物素标记的探针进行杂交，再用链亲和素标记的量子点来检测（Nucleic Acids Res. 2004，32，e28），这种方法标记的量子点粒径太大，由于植物细胞壁的存在，染色体高度浓缩，量子点进入细胞核比较困难，不能应用于植物荧光原位杂交中（J Nanobiotechnology，2006,4,5）；另一种方法是使用量子点标记的寡核苷酸，中国专利申请号201010503053.7公开的“基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法”，用这种方法实现了内共菌的检测。但是这种方法偶联的DNA片段较短（1-100bp），只能进行重复序列的检测，不能进行单拷贝的检测。据文献报道，辛胺修饰的聚丙烯酸的量子点（Octylamine-modified polyacrylic acid coated CdSe/ZnS quantum dots, OPA-coated CdSe/ZnS QDs），单分散性好，粒径较小，稳定性和光学性质好（Bioconjug Chem，2007，18，323）。因此，如果能将这种修饰的量子点偶联的长链DNA分子应用于植物的荧光原位杂交体系中，将大大提高杂交的灵敏度和分辨率，并且这种方法采取直接标记的方法，省去了抗体检测的步骤，可以实现单拷贝基因的快速检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种植物单拷贝基因的检测方法，本方法操作简单、方便易行。

本发明提供的植物单拷贝基因的检测方法，为：

制备植物的间期核、中期染色体或染色质纤维；制备量子点偶联的DNA作为探针；按照传统的荧光原位杂交方法，进行植物单拷贝基因的杂交，然后检测；所述探针的制备具体包括如下步骤：

根据所要检测的目标基因，设计并合成一对寡核苷酸引物，并将其中一个引物的5’端连上5’-NH₂-(CH₂)₆-TTTTTT，并通过氨基（-NH₂）和量子点上的羧基（-COOH）进行化学反应，偶联到量子点表面；

将偶联了量子点的寡核苷酸引物与另外一个引物，以及含有目的片段的DNA模板一起加入聚合酶链式反应体系中，通过聚合酶链式反应得到量子点偶联的长链DNA分子；

通过琼脂糖凝胶电泳分离聚合酶链式反应得到的产物，得到单个量子点偶联的单个长链DNA分子，将其作为探针。

更优选的方案是：

量子点为水溶性的辛胺修饰的聚丙烯酸的量子点（Octylamine-modified polyacrylic acid coated CdSe/ZnS quantum dots, OPA-coated CdSe/ZnS QDs），单分散性好，粒径较小（1-20 nm）。

偶联在量子点表面的DNA长200-600bp，由于荧光原位杂交的探针在200-600bp杂交效果较好。