[发明专利]肠三叶因子重组表达载体及肠三叶因子制备方法无效
| 申请号： | 201110095193.X | 申请日： | 2011-04-15 |
| 公开（公告）号： | CN102212547A | 公开（公告）日： | 2011-10-12 |
| 发明（设计）人： | 彭曦;金星;万千雪;吴丹 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02 |
| 代理公司： | 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 | 代理人： | 赵荣之 |
| 地址： | 400038 重*** | 国省代码： | 重庆;85 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 肠三叶 因子 重组 表达 载体 制备 方法 | ||
1.肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体为如SEQ ID NO:1所示的DNA片段与pGAPZɑA载体连接而成。
2.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体含有如SEQ ID NO:2所示的启动子核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体携带zeocin抗性基因。
4.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体为：由RT-PCR扩增出的如SEQ ID NO:1所示的DNA片段，经EcoRI和NotI双酶切，然后与经EcoRI和NotI双酶切的pGAPZɑA载体连接而成的重组表达载体。
5.根据权利要求1所述的肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体含有组氨酸标签基因。
6.含有权利要求1-5任一项所述的肠三叶因子重组表达载体的工程菌。
7.根据权利要求6所述的肠三叶因子重组表达载体的工程菌，其特征在于：所述工程菌为含有重组酵母表达质粒pGAPZɑA-ITF的酵母菌。
8.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为经100-300μg/ml的zeocin抗性梯度法筛选后或/和再经TCA沉淀法筛选后所得的工程菌。
9.运用权利要求6所述的工程菌制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，所述发酵液含有肠三叶因子。
10.根据权利要求9所述的制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，对发酵液进行浓缩和去杂质后，得肠三叶因子。
11.根据权利要求9或10所述的制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将发酵液离心后取上清液通过中空纤维柱过滤，得过滤液，对过滤液浓缩并沉淀后，用镍离子柱对带组氨酸标签的蛋白进行亲和层析分离纯化，浓缩后得肠三叶因子。
12.根据权利要求9所述的制备肠三叶因子的方法，其特征在于：将所述工程菌种子液在发酵罐内BSM培养基中发酵表达不少于2天，收集发酵液，所述发酵液中含有肠三叶因子。
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