[发明专利]肠三叶因子重组表达载体及肠三叶因子制备方法无效

专利信息
申请号: 201110095193.X 申请日: 2011-04-15
公开(公告)号: CN102212547A 公开(公告)日: 2011-10-12
发明(设计)人: 彭曦;金星;万千雪;吴丹 申请(专利权)人: 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
主分类号: C12N15/81 分类号: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02
代理公司: 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 代理人: 赵荣之
地址: 400038 重*** 国省代码: 重庆;85
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摘要:
搜索关键词: 肠三叶 因子 重组 表达 载体 制备 方法
【说明书】:

技术领域

本发明属于生物技术和工程领域,特别涉及肠三叶因子的制备方法。

背景技术

肠三叶因子(以下简称ITF)是分布于肠道的特异小分子蛋白,分子量约6~7kD。ITF由59个氨基酸残基构成,包含一个由38~39个氨基酸残基组成的特定序列,其中的6个半胱氨酸以1-5,2-4,3-6的顺序依次形成3个二硫键,从而产生特异而稳定的三叶结构。这种稳定的结构确保其在肠道中发挥活性,不受消化酶和pH变化的影响。正常情况下,ITF分布于整个小肠,特别是小肠绒毛环状细胞的基底部。ITF在体内以20%单体和80%二聚体的形式存在,但只有二聚体才具有生物活性。ITF不仅能促进肠上皮细胞增殖和移行,还能同粘蛋白中的寡聚糖或多糖的侧链相连,稳定肠粘液层。因此,ITF对肠道的保护作用非常强,它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。

“Characterization of human and rat intestinal trefoil factor produced in yeast”一文公开了肠三叶因子在酵母中的表达方法,该方法是利用第一代酿酒酵母发酵获得重组肠三叶因子。但它存在的缺陷是:它由实验室扩展到工业规模时,其产量迅速下降,原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失,质粒变得不稳定,拷贝数下降,导致了产量的降低,仅为48mg/L;它的纯化方法烦琐,操作复杂、步骤较多。 美国专利US 20020052483A1公开了应用真核表达载体(如pMAMneo),在COS 细胞、CHO 细胞等真核细胞中表达或直接从肠粘膜中提取肠三叶因子。但按照它所介绍的方法具有以下不足:1.利用真核细胞表达获得肠三叶因子,虽然蛋白活性尚好,但成本较高、产量低,难以大规模生产;2.利用肠粘膜提取肠三叶因子,虽然可以得到天然的肠三叶因子,但其原料(肠粘膜)来源受限,产量非常低,不能用于工业化大规模制备。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种重组表达载体,该重组表达载体可以保证工程菌在后续发酵中有较高的表达量,且无需借助甲醇诱导。

为实现上述目的,本发明的技术方案为:

肠三叶因子重组表达载体,所述肠三叶因子重组表达载体为如SEQ ID NO:1所示的DNA片段与pGAPZɑA载体连接而成。

进一步,所述肠三叶因子重组表达载体含有如SEQ ID NO:2所示的启动子核苷酸序列;

进一步,所述肠三叶因子重组表达载体携带zeocin抗性基因;

进一步,所述肠三叶因子重组表达载体为:由RT-PCR扩增出的如SEQ ID NO:1所示的DNA片段,经EcoRI和NotI双酶切,然后与经EcoRI和NotI双酶切的pGAPZɑA载体连接而成的重组表达载体;

进一步,所述肠三叶因子重组表达载体含有组氨酸标签基因。

本发明的目的之二在于提供一种工程菌,该工程菌能分泌肠三叶因子的,且性质稳定。

为实现上述目的,本发明的技术方案为:

含有所述的肠三叶因子重组表达载体的工程菌。

进一步,所述工程菌为含有重组酵母表达质粒pGAPZɑA-ITF的酵母菌;

进一步,所述工程菌为经100-300μg/ml的zeocin抗性梯度法筛选后或/和再经TCA沉淀法筛选后所得的工程菌。

本发明的目的之三在于提供一种制备肠三叶因子的方法,该方法产量高,成本低,适用于工业生产。

为实现上述目的,本发明的技术方案为:

运用所述工程菌制备肠三叶因子的方法,将所述工程菌连续发酵不低于2天,收集发酵液,所述发酵液含有肠三叶因子。

进一步,将所述工程菌连续发酵不低于2天,收集发酵液,对发酵液进行浓缩和去杂质后,得肠三叶因子;

进一步,将发酵液离心后取上清液通过中空纤维柱过滤,得过滤液,对过滤液浓缩并沉淀后,用镍离子柱对带组氨酸标签的蛋白进行亲和层析分离纯化,浓缩后得肠三叶因子。

进一步,将所述工程菌种子液在发酵罐内BSM培养基中发酵表达不少于2天,收集发酵液,所述发酵液中含有肠三叶因子。

本发明的有益效果为:(1)目的基因整合稳定,易于筛选高表达工程菌;(2)表达产物分泌到胞外,蛋白活性更高且利于纯化;(3)易于进行高密度发酵,表达产量高,适于大规模工业生产;(4)pGAP和pAOX1相比无需甲醇诱导,避免了甲醇污染和火灾隐患(5)表达的蛋白具有更好的生物活性,对宿主菌无毒(6)组成型表达,使用单一碳源,无需诱导,发酵方式简单;(7)pGAP表达量和pAOX1不相上下。

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