[发明专利]肠三叶因子受体的分离方法

权利要求书

1.肠三叶因子受体的亲和层析分离方法，其特征在于,具体包括以下步骤：

A、含有肠三叶因子的固相载体的制备

将带有生物标签的肠三叶因子融合蛋白为配体同亲和层析柱结合，得含有肠三叶因子的固相载体，所述生物标签为多聚组氨酸标签、谷胱甘肽硫转酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、金黄色葡萄球菌蛋白A标签 、多聚精氨酸标签、多聚半胱氨酸标签、多聚苯丙氨酸标签、钙调蛋白结合肽标签 、纤维素结合域 标签、几丁质结合域标签、Flag-标签、c-Myc标签、Protein-C标签、HA-标签、生物素标签、DsbA标签, HAT标签、NusA标签、 Stag标签和SBP标签中的任一种；

B、肠三叶因子及其受体复合物的制备

将肠道上皮细胞的细胞膜组分同步骤A所得含有肠三叶因子的固相载体孵育结合，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，所述洗脱液中含有肠三叶因子-肠三叶因子受体复合物；

C、肠三叶因子受体的获得

用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效液相色谱法或双向电泳法分离步骤B所得肠三叶因子及其受体复合物中的肠三叶因子和肠三叶因子受体，收集肠三叶因子受体。

2.根据权利要求1所述的肠三叶因子受体的亲和层析分离方法，其特征在于,步骤A中所述亲和层析柱的基质材料为镍琼脂糖凝胶、重组蛋白A琼脂糖凝胶、重组蛋白G琼脂糖凝胶、GST琼脂糖凝胶、Amylose琼脂糖凝胶、精氨酸琼脂糖凝胶、赖氨酸琼脂糖凝胶、明胶琼脂糖凝胶、IgG琼脂糖凝胶和几丁质树脂中的任一种。

3.根据权利要求1所述的肠三叶因子受体的亲和层析分离方法，其特征在于,步骤B中所述洗脱液为咪唑、10-20mM还原型谷胱甘肽、麦芽糖、EDTA、DTT、乙二醇、EGTA 、盐酸胍或脲、巯基乙醇或半胱氨酸中的任一种。

4.根据权利要求1所述的肠三叶因子受体的亲和层析分离方法，其特征在于,步骤A中，将转化的含肠三叶因子成熟肽cDNA序列的酵母X-33菌株阳性转化子接种于YPD液体培养基中表达，表达产物上清液经硫酸铵分级沉淀、Ni-NTA亲和层析及超滤离心，得带有生物标签的肠三叶因子融合蛋白，将其作为配体同镍琼脂糖凝胶亲和层析柱结合不少于30分钟，得含有肠三叶因子的固相载体。

5.根据权利要求1所述的肠三叶因子受体的亲和层析分离方法，其特征在于,步骤B中，将肠道上皮细胞加入步骤A所得含有肠三叶因子的固相载体中，翻转混匀,4℃孵育2小时， 以40mmol/L 咪唑的结合缓冲溶液洗涤2-3次,收集并合并洗涤液，所述洗涤液在12000r/min、4℃条件下离心5分钟,收集沉淀，所述沉淀为肠三叶因子及其受体复合物。

6.根据权利要求1所述的肠三叶因子受体的亲和层析分离方法，其特征在于,步骤C中，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离步骤B所得肠三叶因子及其受体复合物中的肠三叶因子和肠三叶因子受体，收集肠三叶因子受体。