[发明专利]肠三叶因子受体的分离方法

说明书

技术领域

本发明蛋白分离纯化领域，特别涉及肠三叶因子的受体的分离方法。

背景技术

肠三叶因子(intestinal trefoil factor，ITF)是由肠道杯状细胞特异分泌的具有特殊“三叶草型结构”空间结构的小分子多肽，能促进肠上皮细胞的增殖、移行和修复重建，和粘蛋白形成稳定的凝胶复合物，稳定肠粘液层。此外，肠三叶因子具有蛋白酶水解抗性和酸碱稳定性，可减轻多种致伤因子造成的消化道损害，是目前公认的胃肠道超级保护因子。肠三叶因子一直未被开发成为一种治疗胃肠损伤的治疗药物，除了工艺上的难点意外，最主要的是其安全性存在争议，即它具有促进肿瘤细胞增殖和移行的特点，在胃肠肿瘤患者中肠三叶因子高表达是恶性程度较高的表现，患者预后一般较差。因此，对肠三叶因子药物的研究必须寻找新的途径。

生长因子一般通过其受体传递胞外信号，发挥生物学活性。因此，对其受体的研究就显得尤为重要，肠三叶因子的生物活性也是通过其受体发挥作用的，针对不同疾病和不同的治疗目的对肠三叶因子受体进行相应的调控能达到较好的疗效。比如在各种原因导致的胃肠粘膜损害疾病的治疗中，希望发挥肠三叶因子促进粘膜修复的作用，可以对其受体进行正性调控，即提高肠三叶因子受体活性，或增强其与肠三叶因子的结合能力，达到增强肠三叶因子促进细胞增殖和移行以修复受损粘膜的作用。相反，在肿瘤的治疗中，希望降低肠三叶因子促进肿瘤增殖和转移的作用，可以通过对其受体进行负性调控，即降低肠三叶因子受体活性，或抑制其与肠三叶因子的结合能力，达到减弱肠三叶因子促进肿瘤细胞增殖和转移的作用。因此，无论在抗胃肠粘膜损伤药物还是在肿瘤治疗药物方面，对肠三叶因子受体的研究都显得十分重要。肠三叶因子受体激动剂或抑制剂有望成为两类重要的治疗药物应用于临床治疗，但其前提是对肠三叶因子受体要有充分的认识，在这方面目前的研究还不够深入。

肠三叶因子受体由于是膜受体，其分离、纯化和鉴定都比较困难，这是导致目前该领域研究进展缓慢的重要原因，肠三叶因子受体的获取是对其进行研究的基础，申请人对肠三叶因子受体进行了深入研究，找到了有效的分离和鉴定方法。受体的研究技术主要还是经典的放射性配体-受体结合，配体-受体结合动力学分析，近年来研究受体及蛋白质与蛋白质之间的相互作用的研究技术也发展起来。如酵母双杂交、免疫共沉淀、Pull-down技术、荧光共振能量转移等等。

经典的放射性配体-受体结合仅仅只能够的到配体与受体之间的相互作用的间接数据，而仅仅证明有受体的存在而不能分离得到未知的受体。免疫组织化学方法或是免疫荧光检查虽然可以直观的看见受体的定位，却也是不能分离得到受体。酵母双杂交通过构建带有DNA结合域（DNA Bindding domain，BD）诱饵质粒和DNA激活区域（activity domain，AD）的猎物质粒，表达含有BD的蛋白X和含有AD的蛋白Y，同过X与Y的相互作用启动酵母菌自身的蛋白表达，从而确定X与Y 的相互作用。并可以获得感兴趣的基因全长cDNA序列。但是存在有较多的假阳性结果，导致结果的不确定性的存在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠三叶因子受体的分离方法，该方法操作简便，重现性好，分离所得肠三叶因子受体特异性好。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

1．肠三叶因子受体的亲和层析分离方法，具体包括以下步骤：

A、含有肠三叶因子的固相载体的制备

将带有生物标签的肠三叶因子融合蛋白为配体同亲和层析柱结合，得含有肠三叶因子的固相载体，所述生物标签为多聚组氨酸标签、谷胱甘肽硫转酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、金黄色葡萄球菌蛋白A标签 、多聚精氨酸标签、多聚半胱氨酸标签、多聚苯丙氨酸标签、钙调蛋白结合肽标签 、纤维素结合域 标签、几丁质结合域标签、Flag-标签、c-Myc标签、Protein-C标签、HA-标签、生物素标签、DsbA标签, HAT标签、NusA标签、 Stag标签和SBP标签中的任一种；

B、肠三叶因子及其受体复合物的制备

将肠道上皮细胞的细胞膜组分同步骤A所得含有肠三叶因子的固相载体孵育结合，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，所述洗脱液中含有肠三叶因子-肠三叶因子受体复合物；

C、肠三叶因子受体的获得

用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效液相色谱法或双向电泳法分离步骤B所得肠三叶因子及其受体复合物中的肠三叶因子和肠三叶因子受体，收集肠三叶因子受体。