[发明专利]一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒及其用途

权利要求书

1.一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由反转录系统和扩增系统组成，其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP mix、hsa-miR-16茎环结构引物和消化后的RNA提取液组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液和U6snRNA扩增引物与U6snRNA荧光标记探针混合液组成。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反转录系统包括：反转录酶0.5μl、反转录缓冲液0.75μl、RNA酶抑制剂0.095μl、hsa-miR-16茎环结构引物1.5μl、去离子水2.08μl、dNTP mix 0.075μl、及消化后RNA样品2.5μl，共计7.5μl。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述扩增系统包括：含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液10ul、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液1ul和U6snRNA扩增引物与U6snRNA荧光标记探针混合液1ul。

4.一种利用上述权利要求中任意一项所述的试剂盒预测脓毒症患者病死率的方法，包括以下步骤：

(1)病例血清样本处理及RNA提取

以促凝管采集促凝血，临床常规血清标本以带分离胶的菲可替管采集，抽取入住ICU脓毒症患者24小时内的血样以及正常人血样，在4℃下以3000rpm离心15min，将上层血清转移至洁净Ep管，再在4℃下以15,000rpm离心30min以去除细胞碎片，吸取上层血清于洁净离心管，-80℃冻存备用；按照mirVana PARIS试剂盒使用说明书从血清中提取总RNA，使用Scandrop测定RNA提取液的A260吸光度值和A260/A280的比值，以评估其浓度；变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后参照DNase I使用说明书，于37℃对RNA提取液消化30min，于-80℃保存备用；

(2)Hsa-miR-16cDNA的合成

反转录体系包括：反转录酶0.5μl、反转录缓冲液0.75μl、RNA酶抑制剂0.095μl、hsa-miR-16茎环结构引物1.5μl、去离子水2.08μl、dNTP mix 0.075μl、及消化后RNA样品2.5μl，共计7.5μl；将以上成分充分混匀、离心后进行反转录，反转录参数设置为：16℃30min，42℃30min，再以85℃5min灭活反转录酶，合成的cDNA置-20℃冻存备用；

(3)hsa-miR-16实时荧光定量PCR的检测

扩增系统包括：含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液10ul、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液1ul；向其中加入1.33ul的反转录产物和7.67ul的去离子水；利用ABI7300系统进行miRNA定量检测，循环参数设定为95℃10min活化Taq酶，然后95℃15sec，60℃1min，共40个循环；选用U6snRNA为内参，U6snRNA的检测使用与hsa-miR-16相同的反转录和荧光定量PCR反应体系以及U6snRNA的引物与探针混合液；

(4)hsa-miR-16脓毒症患者中表达情况分析

通过与内参U6snRNA和正常人的血清含量标准化后计算的2^-△△Ct水平来计算血清中hsa-miR-16的表达水平，凡是表达水平＜1的患者在28内病死几率大，而表达水平＞1的患者28天病死几率小。

5.如权利要求4所述的方法，其特在在于使用Scandrop测定的RNA提取液的A260吸光度值和A260/A280的比值为1.9-2.1

6.如权利要求1所述试剂盒用于预测脓毒症患者病死率的用途