[发明专利]一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒及其用途，属于生物医学诊断领域。

背景技术

脓毒症(Sepsis)是严重创(烧、战)伤、休克、感染、外科大手术患者常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，是多发伤最主要死亡原因之一。目前，脓毒症已成为临床医学面临的突出难题，全世界每年大约1000人中就有3人发生脓毒症和感染性休克，同时这一数字还以每年1.5％～8.0％的速度上升。近年来抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但重症患者病死率仍高达30％～70％。我们前期的研究发现重症脓毒症病死率为31％，而一旦出现休克，病死率则高达75％。在保健医学领域因保健对象普遍年龄较大，多合并有各种慢性疾病，机体贮备能力下降，一旦感染则很容易继发多器官功能衰竭而危及生命。国内的一组保健对象资料回顾性分析发现感染致脓毒症(73.1％，主要是下呼吸道感染)是导致保健对象继发多器官功能不全的最主要因素，而我们的研究发现一旦合并四个脏器以上衰竭，老年患者的病死率高达80％以上，而且我们研究证实现有的感染监测指标C-反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)在动态评价脓毒症病情严重程度方面结果令人沮丧(Sepsis/Severe Sepsis/Septic Shock：CRP：p＝0.711，PCT：p＝0.075)。近年来研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)作为一类新型调节因子在肿瘤的发生发展中起重要作用。应用基因芯片或是实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术对miRNA表达谱研究发现，miRNA可助于多种疾病的诊断和预后评估。脓毒症患者病情发展迅速，病情凶险，对脓毒症患者的早期病情评估，并采取适当的干预治疗将十分有利用改善其预后生存。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于早期预测脓毒症患者的病死率的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种将上述试剂盒用于预测脓毒症患者的28天病死率的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种用于预测脓毒症患者病死率的试剂盒，该试剂盒由反转录系统和扩增系统组成。其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP mix、hsa-miR-16茎环结构引物和消化后的RNA提取液组成，扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液和U6snRNA扩增引物与U6snRNA荧光标记探针混合液组成。

所述反转录系统包括：反转录酶0.5μl、反转录缓冲液0.75μl、RNA酶抑制剂0.095μl、hsa-miR-16茎环结构引物1.5μl、去离子水2.08μl、dNTP mix 0.075μl、及消化后RNA样品2.5μl，共计7.5μl。

所述扩增系统包括：含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液10ul、hsa-miR-16扩增引物与hsa-miR-16荧光标记探针混合液1ul和U6snRNA扩增引物与U6snRNA荧光标记探针混合液1ul。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒预测脓毒症患者病死率的的方法，包括以下步骤：

(1)病例血清样本处理及RNA提取

以促凝管采集促凝血，临床常规血清标本以带分离胶的菲可替管采集，抽取入住ICU脓毒症患者24小时内的血样以及正常人血样，在4℃下以3000rpm离心15min，将上层血清转移至洁净Ep管，再在4℃下以15,000rpm离心30min以去除细胞碎片，吸取上层血清于洁净离心管，-80℃冻存备用；按照mirVana PARIS试剂盒使用说明书从血清中提取总RNA，使用Scandrop测定RNA提取液的A260吸光度值和A260/A280的比值(1.9-2.1)，以评估其浓度；变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后参照DNase I使用说明书，于37℃对RNA提取液消化30min，于-80℃保存备用；

(2)Hsa-miR-16cDNA的合成

反转录体系包括：反转录酶0.5μl、反转录缓冲液0.75μl、RNA酶抑制剂0.095μl、hsa-miR-16茎环结构引物1.5μl、去离子水2.08μl、dNTP mix 0.075μl、及消化后RNA样品2.5μl，共计7.5μl；将以上成分充分混匀、离心后进行反转录(RT)，RT参数设置为：16℃30min，42℃30min，再以85℃5min灭活反转录酶，合成的cDNA置-20℃冻存备用；