[发明专利]一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法无效
申请号: | 201110096675.7 | 申请日: | 2011-04-18 |
公开(公告)号: | CN102181580A | 公开(公告)日: | 2011-09-14 |
发明(设计)人: | 刘东波;张柳莹;王睿 | 申请(专利权)人: | 湖南农安生物技术有限公司 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64 |
代理公司: | 长沙星耀专利事务所 43205 | 代理人: | 赵静华 |
地址: | 410000 湖南省长沙市隆*** | 国省代码: | 湖南;43 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一步法 检测 猪蓝耳病 病毒 核酸 方法 | ||
1.一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法,包括样品采集和处理和检测,其特征在于,所述样品采集将80-100ul动物血液样品滴加至FTA卡样品区内;所述检测包括
(1)设计针对通用型猪蓝耳病病毒的特异性引物和探针,并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团:所述特异性引物是上游引物序列5’GGCAAATGATAACCACGCA 3’;下游引物序列5’ GCATATTTGACAAGGTTTACCACT 3’;所述探针序列是5’ CGGCGCCACGACGGTCAACG 3’, 在其5’端标记FAM荧光基团,在其3’端标记TAMARA淬灭基团;
(2)配制和优化检测体系和反应条件,反应体系为25或50ul的三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH7.8-9.0),上下游引物各0.1-0.5uM,脱氧核苷酸混合物各100-400uM, 探针0.1-0.5uM,莫洛尼小鼠白血病病毒反转录酶100-300U,热稳定性的DNA 聚合酶1-5U,Mg2+-4-8M,均一化参比染料ROX300-500nM,每反应加入前述重悬在三羟甲基氨基甲烷-EDTAE缓冲液中样本1-15ul。
2.根据权利要求1所述的一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法,其特征在于,所述样品的处理包括以下步骤:(1)取样: 用打孔器将FTA样品区整个样品盘打下,把样品盘放入聚合酶链式反应扩增管中; (2) 孵育: 加入400μL pH 8.0的核糖核酸处理缓冲液,并上下吹打两次,盖上盖子,在冰上孵育15分钟,每5分钟混合一次;(3)纯化:加入40ul 3M的乙酸钠和400ul冰预冷的异丙醇,从洗涤溶液中沉淀核糖核酸RNA,在-20℃下孵育1小时; 把管放置在微量离心管内,在12,000 转/分条件下离心5分钟,去除上清液;再用冰预冷的75%乙醇洗涤沉淀颗粒,在12,000 转/分离心5分钟;去除上清液; (4)室温自然干燥约5分钟: 把沉淀重悬在15-50μl 三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法,其特征在于,所述检测是
用荧光PCR检测仪ABI?7300上机检测,设置反应程序为:
荧光信号收集时设定为FAM荧光素。
4.根据权利要求1所述的一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法,其特征在于,核糖核酸处理缓冲液是10mM 三羟甲基氨基甲烷-HCl, 0.1mM EDTA, 200μg/mL糖原和2mM 二硫苏糖醇。
5.根据权利要求1所述的一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法,其特征在于,所述 FTA卡是采用英国产Whatman FTA卡;是一种经化学试剂特殊处理的棉纤维卡片。
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