[发明专利]一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法。

背景技术

现有猪蓝耳病病毒核酸的检测方法有抗体检测和抗原检测。抗体检测往往滞后于抗原检测，从而不能及时准确的快速发现疫病，导致疫病的爆发流行，造成巨大的经济损失；现有抗原检测方法中病毒分离时间长、环境设施要求高，技术水平要求高，而农村及边远地区广大中小养殖户乃至大中型养殖场由于环境设施和人员技术不合要，预警或可疑标本只能送到大型检测中心检测；而且其灵敏度不高；并且存在如何保存RNA不降解，一直是分子生物学领域的难题，迄今没有简便可行的保存方法；传统方法运输和储存这些病毒标本是需要专业的冰冻和运输技术的，这种方法成本高而且需要一定的专业知识，不易推广，从而不能及时和准确地发现疫病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法。以实现现采样、运输和储存方便可行，操作步骤简单快捷，检测灵敏、准确。

一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法，包括以下步骤：

（一）样品采集和处理

（1）点样：将采集的80-100ul动物血液样品滴加至FTA卡样品区内，自然干燥1小时，于阴凉干燥处储存0-9天。

（2）取样： 用打孔器将FTA样品区整个样品盘打下，把样品盘放入聚合酶链式反应扩增管中；

（3） 孵育： 加入400μL核糖核酸处理缓冲液（10mM 三羟甲基氨基甲烷-HCl, pH 8.0, 0.1mM EDTA, 200μg/mL糖原和2mM 二硫苏糖醇），并上下吹打两次，盖上盖子，在冰上孵育15分钟，每5分钟混合一次；

（4）纯化：加入40ul 3M的乙酸钠（pH5.2）和400ul冰预冷的异丙醇，从洗涤溶液中沉淀核糖核酸RNA，在-20℃下孵育1小时； 把管放置在微量离心管内，在12,000 转/分条件下离心5分钟,去除上清液；再用冰预冷的75%乙醇洗涤沉淀颗粒，在12,000 转/分离心5分钟；去除上清液；

（5）室温自然干燥约5分钟：

（6）把沉淀重悬在15-50μl 三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液中。

（二）测量：

（1）设计针对通用型猪蓝耳病病毒的特异性引物和探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团:所述特异性引物是上游引物序列5’GGCAAATGATAACCACGCA 3’；下游引物序列5’ GCATATTTGACAAGGTTTACCACT 3’；所述探针序列是5’ CGGCGCCACGACGGTCAACG 3’， 在其5’端标记FAM荧光基团，在其3’端标记TAMARA淬灭基团；

（2）配制和优化检测体系和反应条件，反应体系为25或50ul的三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH7.8-9.0),上下游引物各0.1-0.5uM,脱氧核苷酸混合物各100-400uM, 探针0.1-0.5uM,莫洛尼小鼠白血病病毒反转录酶100-300U，热稳定性的DNA 聚合酶1-5U,Mg^2+-4-8M，均一化参比染料ROX300-500nM，每反应加入前述重悬在三羟甲基氨基甲烷-EDTAE缓冲液中样本1-15ul。

（3）用荧光PCR检测仪ABI?7300上机检测，设置反应程序为：

荧光信号收集时设定为FAM荧光素。

所述 FTA卡是采用英国产Whatman FTA卡；是一种经化学试剂特殊处理的棉纤维卡片。

本发明的优点：（1）使用FTA卡采集储存样品，样品采集简便，由于FTA是经化学试剂特殊处理的棉纤维卡片，可保护核酸免于酶的损伤，可阻断病毒的受体信号通路以杀灭有害病原体，利于核酸的室温长期稳定保存和运输；利用这种FTA卡，解决了RNA难以保存和运输的难题，使含有RNA样品的FTA卡可按普通邮件邮寄到任何一个中心试验室进行检测。（2）设计针对通用型猪蓝耳病病毒的特异性引物和探针，并将反转录和聚合酶链式反应两步合成一步，免于转管，不仅降低污染风险，而且提高了检测灵敏度。

附图说明

图1是实施例1用FTA卡储存100ul血液,纯化RNA后荧光PCR检测结果图：

（图中从左至右分别为稀释度为10⁰，10¹，10²，  10³的样品的扩增曲线）

图2 是用FTA卡储存的5个血液样本,纯化RNA后荧光PCR检测结果图；