[发明专利]一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

采用纳米磁珠法提取样品中乙肝病毒核酸作为模板，应用TaqMan 荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，并设计竞争性内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性；其中：通过专用软件，根据分析比较乙型肝炎病毒目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及竞争性内标的探针和引物，所述TaqMan荧光探针和竞争性内标分别标记下列其中一种不同颜色的荧光基团：FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET；所述实时PCR产物在60-120个碱基对范围；在实时PCR反应液中，加入一种前述TaqMan荧光探针和引物，通过监测实时PCR反应体系中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒（HBV）的定量检测。

2.根据权利要求1所述一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：所述纳米磁珠法提取样品中乙型肝炎病毒（HBV）核酸的步骤为：首先，取冻存的样品溶化，加入裂解液重悬样品沉淀，65℃ 水浴10min，裂解液与样品的体积比为1：2；然后，加入与样品等体积的结合液混匀，加入25μl磁珠，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉上清；加入3倍样品体积的洗液于离心管中，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉废液；在离心管中加入洗脱液，65℃水浴2min，吸附磁珠，吸取上清，即为目的总核酸，置于4℃或-20℃保存。

3.根据权利要求1或2所述一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：

所述实时PCR反应体系为：包括5mM 的MgCl₂，0.6mg/ml的BSA，pH8.3的20mM Tris-HCl，75 mM 的KCl，2.5 mM 的dNTP，HotStar Taq酶，PCR增强剂，保护剂, 10-50 nM HBV荧光探针, 10-50 nM内标荧光探针, 10-50 nM HBV上下游引物。

4.根据权利要求3所述一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：所述样品包括人源或动物源的血液、精液、唾液。

5.一种如权利要求1所述定量检测乙型肝炎病毒（HBV）方法的试剂盒，包括核酸提取试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标，其特征在于：所述核酸提取试剂中包括蛋白酶K、纳米磁珠、裂解液、结合液、洗液A、洗液B、洗脱液；其中裂解液组成为：其中裂解液组成为：pH8.0的50 mM Tris-HCl、pH8.0的10 mM EDTA、1%SDS、4 M异硫氰酸胍；结合液组成为：5M异硫氰酸胍、pH6.6的20 mM Tris-HCl、37.5%乙醇；洗液A、B组成为：20 mM NaCl、pH7.5的2 mM Tris-HCl、70%乙醇；洗脱液组成为：pH8.0的10 mM Tris-HCl、pH8.0的1 mM EDTA；所述核酸扩增试剂由HBV PCR 反应液、酶混合液-Taq酶& UDG酶、探针1、探针2组成，所述HBV PCR 反应液中包含针对乙型肝炎病毒（HBV）核酸而设计的引物；所述对照品中的阳性对照为非感染性乙型肝炎病毒DNA，阴性对照为无菌双蒸水，强阳性对照为非感染性病毒DNA；所述标准品为含有乙型肝炎病毒（HBV）DNA序列质粒的梯度稀释物；所述内标为竞争性内标，内标探针与HBV目标基因探针采用不同的荧光报告基团标记，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。

6.根据权利要求5所述的定量检测乙型肝炎病毒（HBV）方法的试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增试剂中针对乙肝病毒HBV和竞争性内标设计的TaqMan荧光探针和引物的序列如下：    

HBV 探针：FAM-5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3-BHQ-1

上游引物：5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

下游引物：5’ agcgccgacgggacgtagac’3；

内标探针：HEX-5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3-BHQ-1。

7.根据权利要求5所述定量检测乙型肝炎病毒（HBV）方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸的单一试剂盒。