[发明专利]一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医学临床诊断领域，具体指一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸方法及试剂盒。

背景技术

在我国多种流行性传染病的病原微生物，如艾滋病，病毒性肝炎，结核，梅毒等，对人类健康造成了巨大危害。临床上主要应用免疫学和微生物学等方法对各种病原微生物进行检测和诊断，由于其灵敏性低和周期长等限制，仍不能完全杜绝阳性病原体的漏检和不能及时准确地诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度好、特异性强和诊断快速等优点。但这项技术在进行确定病原体载量时仍存在操作复杂和灵敏性低等缺点，检测技术需要改进和提高。需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低成本和方法的标准化。

核酸分子检测技术中的荧光定量PCR技术已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。这项技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，可以对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋菌、结核分枝杆菌、淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体等病原微生物进行定量测定。目前，常用的病原微生物实时荧光定量PCR技术包括探针类和染料类两种。

近年来，相比于传统的病毒核酸提取技术，市场上涌现了一些简单方便的核酸提取技术。主要涉及两种类型技术：离心柱法病毒核酸提取技术和磁珠法病毒核酸提取技术。前者由于提取技术中的离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，难于普及推广。磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。另外，磁珠提取核酸能够获得较高的回收产率。

在实际进行核酸检测的过程中运用PCR技术，为了排除假阴性结果和确定PCR的反应效率，需要在PCR反应体系中加入内标（内对照分子）。内标可以监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA（RNA）提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。如中国专利申请CN1203366A采用珠蛋白基因等作为内标，CN1664098A采用beta-肌动蛋白作为内标，CN1687454A采用res-1基因作为内标，CN1940087A采用了RNA内标。然而，相对于PCR检测方法，人们对内标的研究工作却相对很少，特别是竞争

性内标，其设计有一定的技术难点。

正是由于PCR反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染可导致阳性结果，灵敏度过高可能会导致假阳性率增加。在导致PCR假阳性的因素中，产物污染是最严重、但又是可以避免的因素之一。为防止PCR产物污染，以避免假阳性和提高PCR诊断技术的稳定性已成为急待解决的问题。在PCR产物或引物中用dU代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。采用一种能识别核酸双链分子中的UTP并降解核酸的UNG酶，在下一次PCR之前对模板及其它反应物进行处理，可以防止因产物污染所致的假阳性。目前我国国家药政部门在接受PCR相关检测试剂盒申报时，已经把是否采用了UNG酶作为审批条件之一。但在目前仍然存在一些技术性问题，如UNG酶的活性保存非常重要。今后，UNG酶及其相应的系统将成为常规PCR检测试剂盒的组份。

检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸的方法目前已有很多，且有很多商业化试剂盒生产。但大部分技术获试剂盒仍存在操作复杂和灵敏性低，准确性差等缺点，检测技术需要改进和提高。需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低成本和方法的标准化。针对这些问题，本发明应用磁珠法获得高纯度核酸，采用竞争性内标和防污染系统降低假阳性和假阴性，大大提高了检测效率，灵敏度和准确性。

发明内容