[发明专利]一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种亚单位流感疫苗中裂解剂的检测方法，特别是使用高效液相色谱检测方法。 

背景技术：

壬苯醇醚-9是一种非离子型表面活性剂，其化学名称为NonylphenylPolyethylene Glycol Ether。在亚单位流感疫苗生产过程中，需加入裂解剂壬苯醇醚-9，对全病毒进行裂解，再经纯化，得到亚单位疫苗。由于非离子性表面活性剂对细胞膜的侵害性，因此疫苗中的裂解剂残留量必须严格控制在一定的安全限量标准之内。以往国内报道过比色法测定裂解剂的方法，但是此方法受方法学限制，不是直接反映裂解剂含量，具有一定误差。 

发明内容：

本发明提供一种亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的检测方法，该方法包括以下步骤： 

(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理， 

(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线， 

(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测， 

(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量； 

其中步骤(1)和步骤(2)之间，以及步骤(2)和步骤(3)之间的顺序可以互换； 

其特征在于，HPLC检测采用的色谱柱是C₄柱。 

本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测采用的色谱柱是ThermoBioBasic-4C₄柱。 

本发明的检测方法，其特征在于步骤(1)的待检亚单位流感疫苗样品的处 理方法为：用4倍体积的甲醇沉淀后上清液作为待测样品。 

本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测时的紫外检测器的波长为275nm。 

本发明的的检测方法，其特征在于HPLC检测时采用体积比为80∶20的甲醇/水作为流动相，流速1ml/min。 

本发明的检测方法，其特征在于步骤1的沉淀温度为-20℃～65℃。 

本发明的检测方法，其特征在于步骤1的沉淀温度为37℃。 

本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为22～37℃。 

本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为33℃。 

优选的本发明的检测方法，该方法包括以下步骤： 

(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理 

取待检亚单位流感疫苗样品200μl，加入800μl甲醇，剧烈震荡30sec，37℃30min，14000rpm离心20min，吸取上清，0.45um滤膜过滤，得到测试液； 

(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线 

精密称取标准品壬苯醇醚-9250μg，用体积比为4∶1的甲醇/水溶解定容至100ml，即得2500μg/ml壬苯醇醚-9溶液，依次稀释定容为1000μg/ml、50μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、5μg/ml，按样品处理方法处理后HPLC测定，以壬苯醇醚-9浓度对峰面积制作标准曲线； 

(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测 

步骤1得到的测试液用和制作标准曲线的同样条件进行HPLC测定，得到色谱图； 

(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量 

其中HPLC的色谱条件为：色谱柱：Thermo BioBasic-4C4柱，4.6mm×150mm，5μm，定量环：20μl，流动相：体积比为80∶20的甲醇：水，流速：1ml/min，紫外检测器检测波长275nm，柱温：33℃，上样量：100μl。 

本发明的检测方法，是根据以下实验进行设计的， 

1.材料与方法 

1.1仪器和药品 

Hitachi L-2000高效液相色谱仪，L-2400紫外检测器，L-2130泵，EZSTART 色谱工作站；Mettler Toledo AL 204电子天平；Beckman Coulter Microfuge 22R台式高速离心机。 

裂解剂标准品壬苯醇醚-9；甲醇为色谱纯；水为Milli-Q(Millipore)超纯水机制备，电阻率18.2MΩ·cm。 

1.2色谱条件 

色谱柱：Thermo BioBasic-4C₄柱(4.6mm×150mm，5μm)，定量环：20ul，流动相：甲醇：水(80：20，v/v)，流速：1ml/min，紫外检测器检测波长275nm，柱温：33℃，上样量：100ul。